Тупицын Н.Н.1, Л.Ю.Гривцова1, М.М.Анохина1, О.К.Непряхина1, J.Brochier2, R.Jones3 and John Wijdenes4
(1 - ГУ Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина РАМН, Москва, Россия; e-mail: cannt@aha.ru; 2 - INSERM U291, Montpellier, France; 3 - HMDS, Leeds, UK; 4 - Diaclone, Besancone, France)
Молекула gp130 - трансдуцерный компонент или ?-цепь рецептора интерлейкина 6 (ИЛ-6Р) - экспрессирована на всех стволовых клетках человека, включая эмбриональные стволовые клетки и гемопоэтические стволовые клетки. Это делает ее перспективной мишенью для воздействия с целью индукции пролиферации или дифференцировки при отсутствии экспрессии на мембране стволовых клеток специфических рецепторов цитокинов семейства ИЛ-6.
В основу проведения работы положены 2 открытых нами ранее феномена.
Первый из них состоит в установлении активированного cтатуса трансдуцерного рецептора gp130 на основе эпитопной структуры молекулы. Инкубация клеток перевиваемых линий множественной миеломы с ИЛ-6 ведет к «исчезновению» функциональных эпитопов gp130 в сайтах димеризации (А1) и присоединения gp80 (B1), а также gp80 в сайтах присоединения gp130 (M182) и связывания ИЛ-6 (М194, М164).
Эпитопы вне функциональных сайтов ИЛ-6 сигналинга С7 (gp130) и М91 (gp80) экспрессированы на том же уровне и указывают на присутствие gp130/80 на мембране клеток: активированная форма рецептора - А1-В1-С7+М182-М91+; неактивированная - А1+В1+С7+М182+М91+ (Tupitsyn et al., 1998; Tupitsyn & Brochier, 2000).
Второй феномен заключается в возможности активации молекулы gp130 не только цитокинами семейства ИЛ-6, но и моноклональными антителами (МКА). Для активации рецептора должны быть использованы 2 МКА. Наиболее распространенные активирующие пары В1+I2, B1+F1 (Autissier et al., 1998) и МКА B-S12, состоящие из B-S12-A5 и B-S12-G7 (Wijdenes et al., 1995; Fourcin et al., 1996; Muller-Newen et al., 2000).
Целью работы явилось изучение активационного статуса gp130 на мобилизованных стволовых клетках (МСК) крови (продукт лейкафереза) и возможности индукции пролиферации и дифференцировки МСК (CD34+) воздействием с помощью МКА на gp130. Эпитопы gp130 изучены на МСК 16 онкогематологических больных и 15 неонкологических больных (травматическая болезнь спинного мозга - ТБСМ). Иммунофенотип МСК больных ТБСМ отличался высокой пропорцией CD45-негативных клеток, что нетипично для нормальных МСК онкогематологических больных и лейкозных CD34+ клеток (Tupitsyn et al., 2006; Kupryshina et al., 2006). Эпитопы gp130/80 изучали с использованием прямых флуорохромных конъюгатов МКА методом проточной цитометрии в гейте CD34+ клеток.
У онкогематологических больных мономорфная экспрессия рецептора gp130 на МСК (от слабой до умеренно положительной) имела место во всех изученных случаях. Изучены 2 эпитопа молекулы gp130 - функциональный эпитоп С7, участвующий в передаче сигнала лейкоз-ингибирующего фактора (ЛИФ) и онкостатина М (ОМ), а также функциональный эпитоп А1, вовлеченный в димеризацию gp130 под действием любого цитокина семейства ИЛ-6. Экспрессия a-цепей ИЛ-6Р на МСК варьировала в широких пределах (от 1 до 60%). В 3 из 15 случаев gp130 находился в активированном состоянии (С7+А1-). В одном из них gp80 (М91) присутствовал на мембране МСК (60%), в двух других - отсутствовал (менее 12%).
У всех 15 больных ТБСМ выявлена экспрессия gp130 на CD34+ МСК. В 13 случаях эпитоп С7 присутствовал на всех CD34+ клетках, в 9 из них отмечено неактивированное состояние gp130 (А1+С7+). У 4 больных рецептор gp130 на МСК находился в димеризованном (активированном) состоянии - С7+А1-. В 2 случаях наблюдалась экспрессия эпитопа А1 при практически полном отсутствии эпитопа С7. В гематологических системах (клетки гемобластозов, стволовые гемопоэтические клетки) такое сочетание эпитопов мембранного gp130 не описано, и теоретически это может соответствовать начальным этапам сигналинга ЛИФ или ОМ.
Проведена оценка активации рецептора gp130 при добавлении к МСК ИЛ-6 у 12 онкогематологических больных. Достоверных колебаний среднего процента gp130-позитивных МСК, выявляемых с помощью МКА С7, не установлено (р > 0,05). Средний процент А1-позитивных МСК после инкубации с ИЛ-6 достоверно снижался (p = 0,02), что подтверждает возможность димеризации gp130 на стволовых гемопоэтических клетках под действием ИЛ-6.
Влияние анти-gp130 МКА на пролиферацию изучено на моделях линий клеток множественной миеломы RPMI 8226 и стволовых клеток KG-1a. Под влиянием стимулирующих МКА количество клеток в культурах достоверно возрастало в сравнении с контрольной парой МКА B1+I1. Наиболее активными были МКА B-S12, B1+F1 и B1+I2.
Установление экспрессии функциональных эпитопов gp130 на МСК онкогематологических больных послужило основанием для изучения возможности индукции пролиферации и мегакариоцитарной дифференцировки этих CD34+ клеток с помощью анти-gp130 МКА. Использовали цитокиновый коктейль оптимальный для стимуляции мегакариоцитарно-коммитированных предшественников, анти-gp130 МКА B-P8, B1+I1 (контроль) и пары МКА, входящие в состав B-S12. Для культивирования клеток использовали полужидкую среду MegaСult-С (StemCell Technologies, Канада), исследования проводили согласно протоколу фирмы-производителя. Смешивали 0,1 мл суспензии обогащенных стволовых CD34+ клеток (1,1х105/мл); 2 мл среды Iscove MDM (IMDM) без цитокинов или с коктейлем цитокинов, оптимизированным для роста мегакариоцитарных колоний или с МКА; 1,2 мл холодного коллагена. На стекла наносили 1,5 мл полученной смеси (5х103 клеток). Инкубировали 10-12 дней при 37°С (5% СО2, >95% влажности).
По окончании инкубации культуры оценивали на предмет роста колоний, фиксировали, высушивали. Специфические мегакариоцитарные колонии и кластеры выявляли окрашиванием на CD61 флуоресцентным методом и изучали на люминисцентном микроскопе Axioplan 2 (Carl Zeiss, Германия).
При низком содержании CD34+ клеток в продукте лейкафереза (<0,5%) практически не наблюдалось роста мегакариоцитарных колоний (КОЕ-Мег) в культурах с/без цитокинов. Отчетливый рост КОЕ-Мег наблюдали в образцах лейкоконцентрата (CD34+ >1,0%) в присутствии цитокинового коктейля.
Сравнительная характеристика действия пар МКА к эпитопам gp130 S12-A5+B-S12-G7, B-S12-G7+B-P8 и B1+I1 (контроль) на рост КОЕ-Мег представлена в таблице 1.
Таблица 1. Влияние анти-gp130 МКА на рост КОЕ-Мег.
Установлено, что стимуляция КОЕ-Мег зависела не только от исходного содержания CD34+ клеток в продукте лейкафереза, но и от пропорции CD61+ клеток в пределах CD34+ клеток. При высокой пропорции CD61+ мегакариоцитарно-коммитированных предшественников (>10%) количество и размеры КОЕ-Мег при использовании МКА почти вдвое большими, чем при использовании коктейля цитокинов. Наиболее эффективной даже в случаях низкого содержания CD61+CD34+ клеток в лейкоконцентрате была смесь МКА B-S12-A5+B-S12-G7.
Таким образом, эпитопы рецептор цитокинов семейства ИЛ-6 gp130 экспрессированы на МСК. В обогащенной популяции CD34+ МСК (продукте лейкафереза) gp130 может присутствовать в неактивированной и активированной формах. Воздействием с помощью МКА можно индуцировать пролиферацию и мегакариоцитарную дифференцировку CD34+ клеток. Это проявляется в увеличении количества КОЕ-Мег и их размера. Способность к стимуляции колониеобразования КОЕ-Мег анти-gp130 МКА взаимосвязана с исходным содержанием CD34+ МСК и пропорцией CD61+ клеток среди них. Относительно возможностей дальнейшего использования подобных научных разработок представляется уместным привести слова профессора G.Janossy (London, UK), высказанные на страницах журнала Haematopoiesis Immunology (2006, V.3, №1):
“It appears that in this area applied science is a precious commodity where academic departments should have a significant role to play that includes mutually beneficent and respected collaboration with industry and large biotechnological companies”.
Литература.
Autissier P., De Vos J., Liautard J., Tupitsyn N. et al. International Immunology. -1998. -V.10. -P.1881-1889.
Fourcin M., Chevalier S., Guillet C. et al. J. Biol. Chem. -1996. -V.271. -P.11756-11760.
Kupryshina N.A., Frenkel M.A., Tupitsyn N.N. //Haematopoiesis Immunology. -2006. -V.3. -№2. -P.5-21.
Muller-Neuwen G., Kuster A., Wijdenes J. et al. J. Biol. Chem. -2000. -V.275, №7. -P.4579-4586.
Tupitsyn N.N., Kadagidze Z.G., Gaillard J.-P. et al. Clinical Laboratory Haematology, 1998, v.20, P.345-352.
Tupitsyn N.N., Yarygin V.N., Bryukhovetsky A.S et al. //Journal of Biological regulators and homeostatic agents. - 2006. -V.20. -№1-2.
Tupitsyn N.N., Brochier J. Tissue antigens, 2000, №1, P.52
Wijdenes J., Heinrich P.C., Muller-Neuwen G. et al. Eur. J. Immunol. -1995. -V.25. -P.3474-3481.
См. также:
Клеточные технологии в коррекции возрастных изменений кожи лица, лечении ран и трофических язв. Результаты клинических исследований
Сравнение цитофенотипических профилей клеток мезенхимального ряда, изолированных из различных тканей человека
Сравнение способности к дифференцировке в ткани мезодермы клеток мезенхимального ряда, изолированных из различных тканей человека
Экспериментальное исследование антиишемического эффекта препарата стволовых клеток пуповинной крови
Влияние стволовых клеток (СК) на течение инфаркта миокарда (ИМ) у свиней при интрамиокардиальном их введении (экспериментальное исследование на свиньях)
Исследование возможности репрограмирования мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, выделенных из жировой ткани человека, после пересадки их в энуклеированный ооцит
Клеточная структура трансплантатов селезеночной ткани, используемых для коррекции экспериментальной инсулиновой недостаточности
Клиническое исследование стимуляция коллатерального кровообращения стволовыми клетками костного мозга
Стволовые клетки: проблемы правового регулирования
Эффективность и безопасность стентирования почечных артерий и трансплантации микста мобилизированных стволовых клеток периферической крови и жировой ткани в почечные и позвоночные артерии у больных реноваскулярной гипертензией атеросклеротического генеза длительностью более десяти лет
...
Обсудить на форуме
