Пыко И. В.1, С. В. Корень2, З. Б. Квачева2, А. С. Федулов1
(1 - Белорусский государственный медицинский университет, и
2 - ГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии, Минск; e-mail: KvachZB@tut.by)
В настоящее время проводится интенсивное изучение свойств костномозговых мезенхимальных стволовых клеток (МСК) с точки зрения их возможного использования в целях заместительной и корригирующей клеточной терапии. Эти клетки мультипотентны - дифференцируются в остеогенном, хондрогенном, адипоцитарном и др. направлениях и обладают способностью к самоподдержанию. Установление оптимальных условий выделения и приготовления культур стволовых мезенхимальных клеток костного мозга необходимо для наращивания клеточной биомассы при разработке подходов лечения различных заболеваний. Необходимым этапом доклинического исследования возможности применения МСК является всестороннее изучение их свойств в культуре, с использованием клеток животных, с последующим исследованием эффективности их трансплантации в эксперименте на примере различных видов лабораторных животных. В настоящее время литературные данные указывают на использование различных методов и различных по составу сред для их выделения и культивирования. В связи с этим необходимо разработать единые протоколы культивирования МСК для их последующего клинического применения. Цель работы - установление условий выделения и культивирования МСК животных, подбор состава ростовой среды и других компонентов, необходимых для накопления и длительного культивирования МСК. Объектом исследования были лабораторные животные - белые мыши и кролики (белые мыши вес - 18 г, кролики вес - 4200-4400 г). Клетки выделяли из костного мозга, полученного из бедренных и большеберцовых костей лабораторных животных. Костный мозг подвергали механической дезаггрегации до формирования клеточной суспензии. Выделение мононуклеарной клеточной фракции проводили методом центрифугирования в градиенте плотности, либо, используя высокую адгезивную способность мезенхимальных стволовых клеток, когда первую смену среды проводили спустя одни сутки после выделения, тем самым обеспечивая удаление неадгезировавшейся клеточной фракции.
В случае культуры МСК, полученных из костного мозга белых мышей, оба метода выделения показали сходные результаты. В случае же стволовых клеток, полученных из костного мозга кроликов, в большей мере напоминающего костный мозг человека, предпочтительным оказалось применение центрифугирования в градиенте плотности в связи с большей долей эритроидной клеточной фракции и большим содержанием жировой ткани.
В последнем случае при центрифугировании в градиенте плотности обеспечивалась более высокая степень очистки мононуклеарной фракции. Приготовленную клеточную суспензию в ростовой среде помещали в культуральные пластиковые флаконы, обработанные для оптимальной клеточной адгезии полиаминокислотами, коллагеном, желатином. В течение 5-14 суток культивирования в термостате при 370С и 5% СО2 наблюдали рост клеток в виде колоний с последующим формированием монослоя клеток, характеризующихся гетерогенностью популяции: округлые, полигональные, фибробластоподобные клетки. Фибробластоподобные клетки составляют 30-80% (рис. 1).
Рис. 1 Морфология культур мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мыши. 12 дней роста in vitro (фазовый контраст). Ув. ? 200.
Определение содержания в полученных культурах МСК производилось методом проточной цитофлуориметрии с использованием специфических маркеров CD 17, 34, 44, 45. Полученные результаты выявили содержание МСК в первичных культурах, по наличию специфических маркеров. Исследовали влияние на пролиферативную активность различных вариантов ростовых сред, в состав которых входила среда ДМЕМ, L-глутамин, разные серии сывороткок плодов коров, антибиотики (гентамицин, амфотерицин-В) или готовые наборы производства фирмы Stem Cell Technologies. Сравнение роста клеток и их морфологического состава при применении готовых наборов и самостоятельно приготовленных сред дало сходные результаты. Но в случае применения самостоятельно приготовленных сред отмечалась определенная нестабильность получаемых результатов, определяемая свойствами конкретной серии используемой эмбриональной телячьей сыворотки (производства фирм). Были определены оптимальные условия выделения и культивирования мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга животных. Эффективность пролиферации МСК костного мозга in vitro зависит от ряда факторов, которые нужно учитывать при приготовлении культур (источник выделения, пригодность той или иной серии сывороток и др.).
См. также:
Новые подходы к регуляции экспрессии чужеродных генов в стволовых клетках
Клеточные технологии в терапии больных с неврологической патологией
Разработка систем искусственного жизнеобеспечения и заместительной клеточной терапии при заболеваниях печени
Трансплантация аутологичных мононуклеарных клеток костного мозга при остром инфаркте миокарда: результаты 6-месячного наблюдения
Дормантные стволовые клетки (ДСК) в эмбриогенезе и канцерогенезе
Особенности взаимодействия опаловых матриц на основе кубических упаковок наносфер SiO2 с клеточными структурами
Регуляция развития стволовых клеток поликлональными антителами
Репрограммирование посредством эмбриональных стволовых гибридных клеток
Клеточные технологии в коррекции возрастных изменений кожи лица, лечении ран и трофических язв. Результаты клинических исследований
Сравнение цитофенотипических профилей клеток мезенхимального ряда, изолированных из различных тканей человека
...
Обсудить на форуме
