Суздальцева Ю. Г. *, В.В. Бурунова*, И.В. Вахрушев**, К.Н. Ярыгин*,**
(*Российский государственный медицинский университет; e-mail: medcellbox@mail.ru; **НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича)
В настоящее время основными направлениями проводимых фундаментальных исследований в области биомедицинских клеточных технологий является разработка технологий получения клеточного материала на основе мультипотентных стволовых клеток, выделенных из постнатальных органов и тканей человека и изучение возможностей применения их в клинической практике с целью воздействия на патологические состояния различного генеза.
В настоящее время специфических маркеров или их комбинаций, которые идентифицировали бы мультипотентные стволовые клетки in vitro или in vivo, не найдено. Мульпотентные стволовые клетки характеризуют совокупностью морфологических, фенотипических и функциональных свойств, в частности способностью клеток дифференцироваться in vitro в костную, жировую, хрящевую ткань.
Целью данного исследования являлось получение культур фибробластов кожи (ФК) человека, фибробластоподобных клеток пуповины (ФП) человека после нормальных родов на 38-40 неделе гестации и мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга человека; а также сравнение способности клеток полученных культур дифференцироваться в жировую, хрящевую и костную ткань.
В полученных адгезивных культурах клеток ФК, ФП и МСК костного мозга человека основная масса клеток имела фибробластоподобную морфологию.
Сравнительный анализ экспрессии цитоплазматических и поверхностных белков в культурах ФК, ФП и МСК костного мозга человека показал, что МСК костного мозга экспрессировали большое количество белков-маркеров, характерных для стволовых и прогениторных клеток, и не экспрессировали белки, характерные для дифференцированных клеток. ФП экспрессировали маркеры как стволовых, так и дифференцированных клеток. ФК обладали высоким уровнем экспрессии белков, характерных для дифференцированных клеток. Таким образом, культура ФП по фенотипическому профилю занимает промежуточное место между практически гомогенной культурой МСК костного мозга и культурой ФК, обладающих свойствами высокодифференцированных клеток.
В связи с предположением о присутствии в полученных культурах ФП и МСК костного мозга прогениторных и стволовых клеток была предпринята попытка оценить количество клеток в этих культурах, способных дифференцироваться в жировую, костную и хрящевую ткань, т.е. мультипотентных клеток.
Дифференцировку полученных культур в жировую ткань проводили в среде, содержащей содержащей 10% лошадиной сыворотки, 0.5 µM гидрокортизона, 0.5 мM изобутилметилксантина, 60 µM индометацина. К 14 дню культивирования в среде дифференцировки в адипоциты 100% ФК, ФП, и МСК костного мозга накапливали жировые вакуоли, окрашенные в красный цвет масляным красным.
Дифференцировку полученных культур в остеобласты проводили в среде, без сыворотки, содержащей 0,2 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ b-глицерофосфата кальция, 10-7 M дексаметазона. Способность клеток дифференцироваться в остеобласты оценивали по уровню экспрессии белков, специфических для костной ткани - костного сиалопротеина и остеонектина, эндогенной щелочной фосфатазы, а также по способности клеток накапливать фосфаты Са.
Было показано, что ФП и МСК костного мозга имеют изначально высокий уровень экспрессии костного сиалопротеина, в отличие от ФК, которые в обычных условиях не синтезируют этот белок. В течение 3 недель в условиях дифференцировки в остеобласты в клетках всех полученных культур уровень экспрессии костного сиалопротеина повышался: менее всего в культуре ФК, более всего в культуре МСК костного мозга. На начальном этапе дифференцировки костный сиалопротеин в ФП и МСК костного мозга главным образом обнаруживался среди белков цитоскелета в пределах цитоплазмы клеток. На более поздних сроках костный сиалопротеин накапливался в значительных количествах в эндоплазматическом ретикулуме, в составе экзоцитируемых вакуолей и в составе экстрацеллюлярного матрикса.
Иммуноцитохимическим окрашиванием клеток на остеонектин было показано, что ФК, ФП и МСК костного мозга на начальном этапе дифференцировки в остеобласты не экспрессировали этот белок. В течение 3 недель в условиях дифференцировки в костную ткань в ФП и МСК костного мозга уровень экспрессии остеонектина повышался. Уровень экспрессии остеонектина в ФК оставался фоновым в течение эксперимента. Остеонектин обнаруживался среди белков цитоскелета в пределах цитоплазмы клеток. В экстрацеллюлярном матриксе этот белок не обнаруживался.
В культурах ФК, ФП и МСК костного мозга в условиях дифференцировки в остеобласты на начальном этапе только отдельные клетки имели невысокий уровень активности эндогенной щелочной фосфатазы. При дальнейшем культивировании уровень активности эндогенной щелочной фосфатазы возрастал. Через 21 день культивирования в условиях дифференцировки в остеобласты в культуре ФК только в отдельных клетках обнаруживался этот фермент.
В культуре ФП, обладающие повышенным уровнем активности эндогенной щелочной фосфатазы, образовывали отдельные, довольно редкие локусы. Только в культуре МСК косного мозга уровень активности эндогенной щелочной фосфатазы возрастал критически практически во всех клетках.
Накопление фосфата Са в клетках полученных культур в условиях дифференцировки в остеобласты визуализировали гистохимическим окрашиванием по методу ван Косса. На начальном этапе дифференцировки фосфаты Са в клетках не обнаруживались. При дальнейшем культивировании в культуре ФК только в отдельных клетках происходило накопление кальция в вакуолях. В культуре ФП можно было обнаружить единичные локусы клеток, обладающих морфологией остеобластов. В культуре МСК костного мозга происходило активное накопление фосфата кальция в вакуолях и образование значительного количества локусов окостенения, приводящее к инициации дифференцирования близлежащих клеток в остеобласты.
Дифференцировку полученных культур в хондроциты проводили в культуре микромасс в присутствии факторов дифференцировки в хондроциты TGF-beta в течение 3 недель. Из полученных микромасс готовили срезы на криотоме. Полученные срезы окрашивали толуидиновым голубым. ФП и МСК образовывали оформленные структуры, характеризующиеся наличием значительной массы экстрацеллюлярного матрикса. ФК при культивировании в микромассах образовывали очень рыхлые структуры, легко распадающиеся на мелкие фрагменты.
Анализ экспрессии хондроитина и коллагенов I и II типов в культуре МСК костного мозга показал, что при длительном культивировании в среде дифференцировки в хондроциты в отсутствие TGF-beta клетки синтезируют и накапливают преимущественно коллаген I типа. Экспрессия коллагена II типа и хондроитина остается на фоновом уровне. Такое соотношение коллагенов I и II типов характерно для фиброзного хряща. Длительное культивирование МСК костного мозга в среде дифференцировки в хондроциты, содержащей TGF-beta, приводило к уменьшению уровня синтеза коллагена I типа и увеличению уровня синтеза коллагена II типа и хондроитина. Такое соотношение коллагенов I и II типов характерно для гиалинового хряща.
При культивировании ФП в среде дифференцировки в хондроциты присутствие TGF-beta не влияло на соотношение клеток, экспрессирующих коллагенов 1 и 2 типов.
Приведенные результаты показали, что только МСК костного мозга обладают способностью дифференцироваться в жировую, хрящевую и костную ткань. Таким образом, на основании совокупности морфологических, фенотипических и функциональных свойств МСК костного мозга могут считаться мультипотентными стволовыми клетками. Основная масса ФП может дифференцироваться только в адипоциты и хондроциты. Только незначительное количество клеток этой культуры способны дифференцироваться в остеобласты. Таким образом, мультипотентными стволовыми клетками может считаться только часть клеток полученной культуры. Основная масса ФП обладает свойствами бипотентных стволовых клеток. ФК могут дифференцироваться только в адипоциты, следовательно, являются унипотентными.
Результаты проведенных исследований показали, что изучение фенотипа и способности к дифференцировке культур клеток и тканей является важным моментом для определения областей применения их в медицинской практике. Проведенные исследования являются экспериментальной основой получения новых клеточных препаратов для практического здравоохранения.
См. также:
Особенности взаимодействия опаловых матриц на основе кубических упаковок наносфер SiO2 с клеточными структурами
Регуляция развития стволовых клеток поликлональными антителами
Репрограммирование посредством эмбриональных стволовых гибридных клеток
Клеточные технологии в коррекции возрастных изменений кожи лица, лечении ран и трофических язв. Результаты клинических исследований
Сравнение цитофенотипических профилей клеток мезенхимального ряда, изолированных из различных тканей человека
Экспериментальное исследование антиишемического эффекта препарата стволовых клеток пуповинной крови
Влияние стволовых клеток (СК) на течение инфаркта миокарда (ИМ) у свиней при интрамиокардиальном их введении (экспериментальное исследование на свиньях)
Исследование возможности репрограмирования мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, выделенных из жировой ткани человека, после пересадки их в энуклеированный ооцит
Клеточная структура трансплантатов селезеночной ткани, используемых для коррекции экспериментальной инсулиновой недостаточности
Бесцитокиновая активация gp130 на мобилизованных стволовых клетках крови (CD34+) ведет к их пролиферации и дифференцировке
...
Обсудить на форуме
