Тепляшин А.С., С.З. Шарифуллина, Н.И. Чупикова
(Институт стволовой клетки; Россия, 107031, г. Москва, ул. Кузнецкий Мост, д. 17, стр.1.; e-mail: lana_sh@mail.ru)
Взрослая соматическая клетка может перепрограммироваться после переноса ядра в энуклеированную неоплодотворенную яйцеклетку [1, 2, 3] и при слиянии взрослой специализированной клетки с ЭСК [4, 5]. Полноценность бластоцист, полученных методом пересадки ядер, доказывается как получением живого потомства, так и выделением эмбриональных стволовых клеток из их внутриклеточной массы. Под влиянием неизвестных факторов в ядре соматической клетки происходит активация генов раннего эмбриогенеза, и клетка приобретает свойства плюрипотентности.
Данный факт послужил толчком к изучению возможности получения линий пациент-специфичных эмбриональных стволовых клеток выделенных из бластоцист развившихся после аутогенной пересадки ядер (NT-hESC). Для этого в яйцеклетку с предварительно удаленным ядром пересаживается ядро или целая клетка пациента, затем реконструированный ооцит развивается до стадии бластоцисты, из которой получают ЭСК. Так как генетический набор данных клеток идентичен таковому пациента, то при их использовании в восстановительной терапии исключается вероятность возникновения иммунной несовместимости. Возможность получения NT-hESC впервые продемонстрировано в 2000 году на мышах [6, 7] и в последствии подтверждено рядом исследований [8, 9, 10].
Работы по получению NT-hESC человека ориентированы в двух направлениях. В первом случае, в качестве источника цитопласта используются женские донорские яйцеклетки [3], во - втором пересадка ядер осуществляется в ооциты животных [11, 12].
Многолетний опыт по переносу ядер соматических клеток в энуклеированный ооцит с целью клонирования организма и создания линий эмбриональных стволовых клеток показал, что успех процедуры зависит от типа донорского ядра. Установлено, что при использовании ядра ЭСК вероятность рождения живого потомства повышается в 5-10 раз [13].
Есть предположение и этому существуют доказательства, что полностью репрограммировать ядро стволовой или прогениторной клетки легче, чем терминально дифференцированной. Так, у человека первые бластоцисты, развившихся после пересадки ядер, получены, когда в качестве источника кариопласта использовались эмбриональные стволовые клетки человека. Справедливость такого подхода недавно была показана и в эксперименте, использующем в качестве донора ядра нейральную стволовую клетку [14].
Нами была исследована возможность репрограмирования ядер мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) полученных из жировой ткани человека при пересадке их в энуклеированный ксеногенный ооцит.
Методы и результаты исследований.
Полученные из яичников различных возрастных групп ооциты культивировали в среде созревания при 38.5°С и 5% СО2 в воздухе до стадии созревания. Для энуклеации использовались освобожденные от кумулюса ооциты, имеющие четкое направительное тельце.
ММСК получали из жировой ткани человека по разработанной нами методике [15]. С целью синхронизации клеточных циклов ядер донорских клеток и ооцитов монослой ММСК культивировали двое суток со средой, не содержащей сыворотки.
Микроманипуляции с донорскими клетками и ооцитами проводились в микрокаплях среды ТСМ-199 содержащей 25 мМ НЕPES под слоем минерального масла. Ооциты энуклеировали удаляя полярное тельце и метафазные хромосомы, после чего качество извлечения ДНК проверяли по свечению вследствие окрашивания Hoechst 33342. ММСК подходящего размера пересаживали индивидуально в перевителлиновое пространство энуклеированного ооцита. Для энуклеации и пересадки были использованы различные приемы. Объединение мембраны донорской клетки и цитоплазматической мембраны ооцита проводили в камере для электрослияния. На данном этапе нами была исследована эффективность различных параметров слияния, составов используемых для этого буферных растворов, а также вида и времени активации полученных гибридов.
Реконструированные яйцеклетки культивировали в соответствующей среде и оценивали способность к развитию каждые 24 часа.
Результаты экспериментов показали, что используемая нами система созревания ооцитов позволяет получать в среднем 60% яйцеклеток с четкими направительными тельцами. В следствии оптимизация приемов энуклеации и пересадки донорских клеток успешно реконструируются 8 из 10 яйцеклеток. Нами подобраны режимы электрослияния и составы буферных растворов обеспечивающих слияние цитоплазматических мембран ооцитов и пересаженных ММСК в 50% случаев. Активированные гибриды обладают способностью к развитию (треть из них дробится). В настоящее время нами получены зародыши прошедшие три цикла деления.
Таким образом, результаты дают косвенное подтверждение того, что ядра мультипотентных мезенхимных стромальных клеток выделенные из жировой ткани человека способны репрограмироваться при пересадке в энуклеированный ооцит животного. Мы продолжаем свои исследования, так как считаем, что результат можно улучшить, идя в направлении подбора оптимальных культуральных условий для полученных гибридов.
Список литературы.
1. Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ & Campbell KHS 1997. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature. 385 810-813.
2. Wilmut I, Beaujean N, De Sousa PA, Dinnyes A, King TJ, Paterson LA, Wells DN & Young LE 2002 Somatic cell nuclear transfer. Nature. 419 583-587
3. Meng L, Ely JJ, Stouffer RL et al. Rhesus monkeys produced by nuclear transfer. Biol Reprod 1997; 57: 454-459.
4. Stojkovic M, Stojkovic P, Leary C et al. 2005. Derivation of a human blastocyst after heterologous nuclear transfer to donated oocytes. Reprod Biomed Online .11:226-231.
5. Tada M., Tada T., Lefebvre L., Barton S.C., Surani M.A. 1997. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. EMBO Journal. 16: 6510-6520
6. Cowan C.A., Atienza ., Melton D.A., Eggan K. 2005. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells. Science. 309:1369-1373
7. Vanessa J. Hall, Petra Stojkovic, Miodrag Stojkovic 2006 Using Therapeutic Cloning to Fight Human Disease: A Conundrum or Reality? Stem Cells. 24 (7): 1628-1637
8. Munsie MJ, Michalska AE, O’Brien CM et al. 2000. Isolation of pluripotent embryonic stem cells from reprogrammed adult mouse somatic cell nuclei. Curr Biol. 10:989-992
9. Kawase E, Yamazaki Y, Yagi T et al.2000. Mouse embryonic stem (ES) cell lines established from neuronal cell-derived cloned blastocysts. Genesis. 28:156-163.
10. Barberi T, Klivenyi P, Calingasan NY et al. 2003. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21:1200-1207.
11. Ying CHEN et.al. 2003. Embryonic stem cells generated by nuclear transfer of human somatic nuclei into rabbit oocytes. Cell Res. 13(4): 251-263.
12. Chang K.H .et.al. 2003 Blastocyst formation, karyotype, and mitochondrial DNA of interspecies embryos derived from nuclear transfer of human cord fibroblasts into enucleated bovine oocytes. Fertil.Steril. 80(6): 1380-1387.
13. Alberio R., Campbell K.H. Johnson A.D. 2006. Reprogramming somatic cells into stem cells. Reproduction. 132(5): 709 - 720.
14. Belloch R., Wang Z., Meissner A et.al. 2006. Reprogramming afficiency following somatic cell nuclear transfer is influenced by the differentiation and methylation state of the donor nucleus. Stem Cells. 24(9): 2007-2013.
15. Internetional Patent Application. PCT/EP 2005/003502. Method for obtaining of mesenchymal stem cells.
См. также:
Клеточные технологии в коррекции возрастных изменений кожи лица, лечении ран и трофических язв. Результаты клинических исследований
Сравнение цитофенотипических профилей клеток мезенхимального ряда, изолированных из различных тканей человека
Сравнение способности к дифференцировке в ткани мезодермы клеток мезенхимального ряда, изолированных из различных тканей человека
Экспериментальное исследование антиишемического эффекта препарата стволовых клеток пуповинной крови
Влияние стволовых клеток (СК) на течение инфаркта миокарда (ИМ) у свиней при интрамиокардиальном их введении (экспериментальное исследование на свиньях)
Клеточная структура трансплантатов селезеночной ткани, используемых для коррекции экспериментальной инсулиновой недостаточности
Бесцитокиновая активация gp130 на мобилизованных стволовых клетках крови (CD34+) ведет к их пролиферации и дифференцировке
Клиническое исследование стимуляция коллатерального кровообращения стволовыми клетками костного мозга
Стволовые клетки: проблемы правового регулирования
Эффективность и безопасность стентирования почечных артерий и трансплантации микста мобилизированных стволовых клеток периферической крови и жировой ткани в почечные и позвоночные артерии у больных реноваскулярной гипертензией атеросклеротического генеза длительностью более десяти лет
...
Обсудить на форуме
