Ревищин А.В., Корочкин Л.И., Рыбалкина Е.Ю., Мануилова Е.С., Тарантул В.З., Гривенников И.А., Павлова Г. В
(Институт биологии гена РАН; 119334 Москва, ул. Вавилова 34/5; Институт проблем экологии и эволюции им А.Н. Северцова РАН 119071, Москва, Ленинский проспект 33; Институт молекулярной генетики РАН; 123182, Москва, пл. Курчатова 2; e-mail: revishchin@mail.ru)
Трансплантация прогениторных нервных клеток является потенциальной возможностью восполнения функционального дефицита, возникающего в результате отмирания нейронов в ЦНС. Одним из путей улучшения выживания трансплантированных клеток является введение в состав трансплантата клеток - носителей трофических и антиапоптозных факторов. В проведенных ранее экспериментах показано, что присутствие клеток дрозофилы, трансфицированных генами нейротрофических факторов, в составе трансплантируемых фетальных клеток способствует выживанию последних и уменьшает образование глиального рубца.
Особенно эффективным оказался метод, заключающийся в использовании для ксенотрансплантации клеток дрозофилы, несущих гены нейротрофических факторов, находящихся под контролем промотора белка теплового шока hsp 70. Экспрессия генов нейротрофических факторов в клетках дрозофилы, трансплантированных крысам запускалась нормальной температурой тела млекопитающих.
Эффект трансгенных нейротрофических факторов усугублялся выделяемым клетками дрозофилы хитшоковым белком hsp 70. Этот белок оказывал протективное действие как на трансплантированные клетки, так и на ткань реципиента.
С целью создания новых управляемых невирусных генных конструкций нами была создана конструкция для трансфекции клеток млекопитающих, в которой в качестве управляющего элемента используется промотор белка теплового шока hsp 70 дрозофилы. В результате был получен оптимальный вектор LP1, содержащий температурно-зависимый промотор невирусной природы. Полилинкер данного вектора позволяет создавать химерные конструкты с маркерным флуоресцентным геном на N конце. Для исследования работы созданной конструкции эибриональные стволовые клетки мыши (линия R1) трансфицировали конструкцией содержащей голубой флуоресцентный белок под контролем упомянутого промотора дрозофилы. Экспрессия репортерного белка наблюдалась только после краткосрочного (20 минут) нагревания трансфицированных клеток до 42 градусов. По-видимому хитшок-стимулирующий фактор млекопитающих реагировал с хитшоковым промотором дрозофилы только при температуре хитшока теплокровных. После повторной трансфекции клеток конструкцией с белком HSP83 человека под вирусным CMV промотором экспрессия маркерного флуоресцентного белка первой конструкции наблюдали постоянно.
В дальнейших экспериментах аналогичная конструкция, содержащяя ген зеленого флуоресцентного белка под тем же промотором тарнсфицировали в клетки человека линии HEK293. В трансфицированных клетках репортерный белок экспрессировался только спустя 12 часов после кратковременного нагревания клеток до 39 градусов. Экспрессия продолжалась два дня. В последствии при повторном воздействии нагреванием экспрессию можно было возобновить с той же задержкой. В экспериментах по трансплантации трансфицированных клеток в мозг взрослых мышей наблюдали слабую экспрессию флуоресцентного белка на срезах мозга, изготовленных через 2 суток после трансплантации.
В работе показано, что полученный вектор позволяет создавать конструкции, содержащие терапевтические гены, экспрессия которых может управляться с помощью повышения температуры в физиологических пределах или посредством воздействия дополнительных белковых продуктов. Полученный вектор позволит использовать дрозофильные промоторы для создания конструкций, трансформирующих стволовые клетки с целью их последующего использования в клеточной терапии.
Рис. 1 Новый вектор для введения чужеродных генов в клетки млекопитающих.
Рис. 2 Встраивание полученного вектора в клетки мозга млекопитающих in vivо.
См. также:
Исследование условий пролиферации мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток костного мозга в культуре
Клеточные технологии в терапии больных с неврологической патологией
Разработка систем искусственного жизнеобеспечения и заместительной клеточной терапии при заболеваниях печени
Трансплантация аутологичных мононуклеарных клеток костного мозга при остром инфаркте миокарда: результаты 6-месячного наблюдения
Дормантные стволовые клетки (ДСК) в эмбриогенезе и канцерогенезе
Особенности взаимодействия опаловых матриц на основе кубических упаковок наносфер SiO2 с клеточными структурами
Регуляция развития стволовых клеток поликлональными антителами
Репрограммирование посредством эмбриональных стволовых гибридных клеток
Клеточные технологии в коррекции возрастных изменений кожи лица, лечении ран и трофических язв. Результаты клинических исследований
Сравнение цитофенотипических профилей клеток мезенхимального ряда, изолированных из различных тканей человека
...
Обсудить на форуме
