Суздальцева Ю. Г. *, В.В. Бурунова *, И.В. Вахрушев**, К. Н. Ярыгин*, **.
(*Российский государственный медицинский университет; e-mail: medcellbox@mail.ru; **НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича)
Разработка эффективных биомедицинских технологий получения и применения в терапевтических целях препаратов стволовых, прогениторных и дифференцированных клеток человека становится одним из приоритетных направлений современной науки. Наряду с использованием традиционных источников тканей человека для получения адгезивных культур клеток, таких как кожа и костный мозг, актуальной задачей остается поиск альтернативных источников тканей для получения стволовых и прогениторных клеток. В качестве альтернативного источника получения стволовых и прогениторных клеток нами предложен пупочный канатик (Вартонов студень) человека после нормальных родов на 38-40 неделе гестации. Использование пупочного канатика в качестве источника получения клеток не имеет морально-этических препятствий, т. к. пуповины забираются после нормальных родов. Культуры фибробластоподобных клеток пуповины являются более технологичными по сравнению с культурами клеток из костного мозга и кожи. Культуры клеток пуповины, содержат большое количество стволовых и прогениторных клеток.
Целью данного исследования являлось получение культур фибробластов кожи (ФК) человека, фибробластоподобных клеток пуповины (ФП) человека после нормальных родов на 38-40 неделе гестации и мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга человека; анализ экспрессии белков в полученных культурах методами иммуноцитохимии и проточной цитофлуориметрии,
Основная масса клеток полученных культур ФК, ФП и МСК костного мозга имела фибробластоподобную морфологию. Все полученные культуры были исследованы на экспрессию цитоплазматических белков: виментина, нестина, коллагена 1 и 2 типов. Проведенный сравнительный анализ клеток полученных культур показал как сходство, так и существенные различия между ними. Все клетки полученных культур экспрессировали виментин - белок цитоплазматического скелета клеток, что является характерным для клеток мезенхимального ряда. Значительная часть популяции ФП экспрессировала нестин - маркер незрелых и прогениторных клеток. Экспрессия нестина ФП может быть связана с происхождением их из трофобласта плода. ФК и МСК костного мозга нестин не экспрессировали. Значительная часть популяции ФП экспрессировала коллаген 1 типа. В культуре клеток ФК только единичные клетки экспрессировали этот белок. МСК костного мозга не экспрессировали коллаген 1 типа. Значительная часть популяции ФП экспрессировала коллаген 2 типа. ФК и МСК не экспрессировали коллаген 2 типа.
Высокий уровень экспрессии ФП коллагенов 1 и 2 типов объясняется, по-видимому, тем, что функцией этих клеток является образование специальной соединительной ткани, так называемого Вартонова студня, который окружает сосуды пуповины. Двойное иммуноцитохимическое окрашивание ФП на коллаген 2 типа и нестин показало, что в культуре присутствуют клетки, экспрессирующие только коллаген 2 типа, только нестин, а также клетки коэкспрессирующие колаген 2 типа и нестин.
В культуре ФП значительное количество клеток экспрессировали маркер эндотелиоцитов - фактор фон Виллебранда. Пассирование культуры ФП не приводило к изменению числа клеток, экспрессирующих фактор вон Виллебранда. Количество клеток, экспрессирующих фактор фон Виллебранда, (около 20%) в культуре МСК костного мозга уменьшалось при пассировании и к третьему пассажу они исчезали из культуры. На ФК фактор фон Виллебранда не выявлялся.
Полученные культуры были также охарактеризованы по уровню экспрессии поверхностных белков-маркеров стволовых клеток CD34, CD44, CD45, СD49b, CD54, CD90, CD105, CD106, СD117, HLA-DR методом проточной цитофлюориметрии.
Все клетки полученных культур были отрицательными по экспрессии белков-маркеров гемопоэтических стволовых клеток CD34, CD45 и HLA-DR .
Высокий уровень экспрессии молекул клеточной адгезии CD44, СD49b, CD54, CD90, CD106, играющих большую роль в процессе миграции и хоуминга клеток, характерен для клеток мезенхимального ряда.
В комплекс белков CD44 помимо молекулы адгезии, входит также белок-транспортер pgp1, позволяющий поддерживать внутриклеточный гомеостаз и высокий уровень пролиферации даже в неблагоприятных условиях. Высокий уровень экспрессии CD44 обнаруживался в культурах клеток ФК. Средний уровень экспрессии CD44 обнаруживался в культуре ФП и МСК.
Значительные различия среди полученных культур выявлены по уровню экспрессии CD54, в состав которого входит молекула межклеточной адгезии (ICAM), которая является лигандом для ?2-интегринов. Известно, что уровень экспрессии CD54 повышается у клеток, дифференцирующихся в ткани опорного аппарата (кость, хрящ). Высокий уровень экспрессии CD54 был выявлен в культуре ФП. Однако в культуре ФП встречались крупные распластанные клетки, экспрессирующие эти белки на фоновом уровне. Средний уровень экспрессии CD54 был выявлен в культуре МСК костного мозга. ФК практически не экспрессировали этот маркер.
Наряду с маркером эндотелиоцитов - фактором фон Виллебранда МСК костного мозга экспрессировали молекулу адгезии эндотелиоцитов - VCAM (CD106). ФК и ФП этот белок не экспрессировали.
Уровень экспрессии СD49b (?2?1 integrin) был одинаково низким в ФК и ФП. МСК костного мозга не экспрессировали этот маркер.
Клетки полученных культур обладали одинаково высоким уровнем экспрессии СD90, относящегося к семейству иммуноглобулиноподобных рецепторов.
Важной характеристикой присутствия в полученных культурах стволовых и прогениторных клеток является наличие экспрессии в клетках рецепторов к факторам роста и трансформации. Продукт гена c-kit (CD117) представляет собой рецептор к фактору стволовых клеток (SCF), который регулирует митотическое деление и запуск антиапоптотических событий в прогениторных клетках. ФП и МСК костного мозга обладали средним уровнем экспрессии CD117. ФК не красились антителами против этого белка.
Полученные культуры не различались по уровню экспрессии CD105 (эндоглин), являющимся рецептором к TGF-beta и запускающим каскад реакций, изменяющих морфологию и адгезивные свойства клеток. Уровень экспрессии CD105 был средним во всех культурах.
Полученные результаты показали, что МСК костного мозга экспрессировали большое количество поверхностных белков, характерных для мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток и практически не экспрессировали цитоплазматические белки, характерные для дифференцированных клеток. Популяция МСК полученной культуры была практически однородной по экспрессии исследованных маркеров. Культура ФП была неоднородна и содержала, по крайней мере, три субпопуляции клеток, а)- экспрессировавших только поверхностные и цитоплазматические белки-маркеры мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток, б)- коэкспрессировавших маркеры мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток и маркеры дифференцированных клеток, в)- экспрессировавших только белки-маркеры дифференцированных клеток. ФК экспрессировали только некоторые поверхностные белки-маркеры, характерные для мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток, и в значительной мере белки-маркеры дифференцированных клеток.
Таким образом, культура ФП по фенотипическому профилю занимает промежуточное место между практически гомогенной культурой МСК костного мозга и культурой ФК, обладающих свойствами высокодифференцированных клеток.
См. также:
Дормантные стволовые клетки (ДСК) в эмбриогенезе и канцерогенезе
Особенности взаимодействия опаловых матриц на основе кубических упаковок наносфер SiO2 с клеточными структурами
Регуляция развития стволовых клеток поликлональными антителами
Репрограммирование посредством эмбриональных стволовых гибридных клеток
Клеточные технологии в коррекции возрастных изменений кожи лица, лечении ран и трофических язв. Результаты клинических исследований
Сравнение способности к дифференцировке в ткани мезодермы клеток мезенхимального ряда, изолированных из различных тканей человека
Экспериментальное исследование антиишемического эффекта препарата стволовых клеток пуповинной крови
Влияние стволовых клеток (СК) на течение инфаркта миокарда (ИМ) у свиней при интрамиокардиальном их введении (экспериментальное исследование на свиньях)
Исследование возможности репрограмирования мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, выделенных из жировой ткани человека, после пересадки их в энуклеированный ооцит
Клеточная структура трансплантатов селезеночной ткани, используемых для коррекции экспериментальной инсулиновой недостаточности
...
Обсудить на форуме
