Зарайский Е.1, Рыбалкина Е.2, Титова Е.2, Ревищин А.2, Афанасьев Б.2 Мулик Е.Л.3, Корочкин Л. И.4
(1 - НИИ Морфологии человека РАМН; e-mail: zarazara@yandex.ru; 2 - 14 Окружной военный госпиталь, Красногорск; 3 - Клиника Семейный доуктор, Москва; 4 - Институт биологии гена РАН)
Реабилитация больных с грубой нейральной патологией важная теоретическая и практическая задача. Настоящая работа посвящена изучению аутологичных стромальных костномозговых клеток и перспективам их терапевтического применения.
Материалы и методы:
Флаконы фирмы Corning inc. емкостью 25, 75 и 225 см2, 24-луночные плашки фирмы Corning inc., пипетки GreinerBioOne, для подсчета клеток использовали камеру Горяева.
Использованные среды: среда Dulbeccos Modified Medium (DMEM), F12 фирм ПанЭко (Россия) и Sigma(USA), пируват натрия Sigma, незаменимые аминокислоты Sigma, сыворотка эмбриональная телячья фирмы ПанЭко, гентамицин.
Для культивирования использовали костный мозг пациента Ч., 25 лет.
Супернатант - клетки, которые получили путем дезагрегации стромы костного мозга;
Первичные клетки - клетки, которые выделились из стромы при транспортировке;
Фрагменты-кусочки симфиза бедренной кости с матриксом костного мозга;
Слив - супернатант, слитый из всех трех флаконов с вышеназванными субкультурами в отдельный флакон.
Изначально получили 40 мл первичных клеток (доля мертвых клеток - 5,3%), 26,5 млн. клеток, сажали по 5 мл на флакон 225 см2 (по 12,5 живых клеток). Супернатант после его выделения получили в количестве 40 мл, 29,75 млн.кл. (доля мертвых клеток - 14,94%). Посадили клетки в том же количестве, что и первичные.
Фрагменты диаметром 0,3см сажали на флаконы 225см2 в количестве 10-15 фрагментов на флакон. Для наблюдения за клетками использовали инвертированный микроскоп фирмы Leica, увеличение 40Х.
Зависимость колониеобразования от способа посадки
Первичные клетки стромы костного мозга сажали на 25см2 флаконы. При посадке использовали среду состава DMEM (ПанЭко)1/2часть, F12 (ПанЭко)1/2часть, Пируват натрия 1Х, Незаменимые аминокислоты 1Х, Гентамицин 6,4мкг/мл, Сыворотка эмбриональная 10%.
Далее клетки вели на среде следующего состава:DMEM (Sigma) 1/2часть, F12 (Sigma)1/2часть, Пируват натрия 1Х, Незаменимые аминокислоты 1Х, Гентамицин 6,4мкг/мл, Сыворотка фетальная 10%.Были исследованы следующие варианты плотности посадки стромальных клеток: 1 млн, 0,5 млн, 0,25 млн. клеток на флакон.
Целью нашего наблюдения были
1) Время заполнения монослоя
2) Время появления первых прикрепленных клеток.
На шестой день культивирования были видны первые севшие клетки во всех флаконах.
На восьмой день получили следующие промежуточные результаты:
На 13 день клетки во флаконе 1 доросли до монослоя. При подсчете в камере Горяева клеток, прошедших обработку трипсином, оказалось 1млн клеток на флакон (на 25см2).
На 26 день во флаконе 2 клетки доросли до монослоя. При подсчете - 1млн. клеток на флакон.
На 31 день флакон 3 дорос до монослоя. Число клеток в нем было также 1млн.
Зависимость роста клеток от качества среды.
В 24-луночную плашку сажали по 250000 клеток на лунку.
Тестировали три варианта среды:
В каждую лунку добавляли по 2мл среды, культивировали клетки 8 дней.
Оптимизация посадки стромы костного мозга
Осуществляли посадку клетки стромы костного мозга в следующем порядке:
Таким образом оптимальным оказался способ посадки культуры стромы костного мозга в среду содержащую среды производства фирмы Sigmа, DMEM 1/2часть и F12 1/2часть, Пируват натрия 1Х, Незаменимые аминокислоты 1Х, Гентамицин 6,4мкг/мл
Сыворотка фетальная-20%. Исходная кульура обладала фенотипом фибронектин+, СD3-, CD4-, нестин-, но росле стимуляции раствором, содержащим 10-6 М ретиноевой кислоты в течение 3-7дней превращались в 84% случаев в нестин -позитивные. Мы предположили, что это доказывает их полипотентность и спообность превращаться в прогениторные нейроциты. Была предпринята попытка терапевтического использования полученных. Пациентке 14 лет с диагнозом «Последствия герпетического менингоэнцефалита с субтотальной энцефаломаляцией. Энцефалопатия.
Выраженное нарушение высших корковых функций» трансплантировали 106 аутологичных клеток стромы костного мозга, преобработанных ретиноевой кислотой, как описано выше эндолюмбально. Через 4 месяца у пациентки восстановились некоторые бытовые навыки, письмо, исчезли симптомы орального автоматизма.
См. также:
Патогенетическое обоснование применения фетальных клеток человека
Перспектива использования аквакомплекса глицеросольвата титана и дерината с целью увеличения выживаемости и поддержания пролиферативного потенциала стволовых клеток радиочувствительных тканей после воздействия ионизирующего излучения
Исследование влияния различных модификаций коллаген-хитозановых матриц на эффективность заживления ожогов у крыс как этап создания подложек для культивирования и направленной дифференцировки стволовых клеток
Апробация сочетанного применения аутологичных мезенхимных стволовых клеток и остеотропного материала для лечения пародонтита
Результаты клинического применения гибридных имплантатов для коррекции осложнений диабета
Терапия ишемического инсульта головного мозга у крыс с помощью мезенхимных стволовых клеток
Влияние сроков трансплантации МСК на эффективность терапии экспериментального инсульта головного мозга
Аутологичные фибробласты в косметологии
Влияние искусственных поверхностей на остеогенную дифференцировку пула мезенхимальных стромальных клеток костного мозга in situ
Аллогенные клеточные трансплантации пренатальных и постнатальных мультипотентных стромальных клеток в лечении хронической сердечной недостаточности у пациентов с дилатационной кардиомиопатией
...
Обсудить на форуме
