Друй А.Е., А.П. Ястребов, И.А. Микеров, Д.Ю. Гребнев,
(Уральская государственная медицинская академия; 620000, Россия, Екатеринбург, ул. Ключевская, 17, УГМА, кафедра патологической физиологии; e-mail: Dr-Drui@yandex.ru)
Ранние постлучевые реакции, в основном со стороны пищеварительного тракта и гемопоэтической системы, обусловлены массовой элиминацией клеток в первые часы после воздействия ионизирующего излучения (ИИ). В первую очередь, репродуктивной гибели подвержены быстропролиферирующие клетки-предшественники, тогда как стволовые клетки (СК) обладают большей радиорезистентностью и обуславливают постлучевое восстановление клеточной популяции. Высокая резистентность СК к действию ИИ по сравнению с быстропролиферирующими предшественниками определяется меньшей скоростью их деления и высокой активностью ферментных систем репарации ДНК (высокий репаративный потенциал), что находит свое отражение в наличии «плеча» на кривых клеточной выживаемости, которое интегрально характеризует способность клеток к восстановлению радиационных повреждений, и в среднем составляет 4 Гр для СК различных популяций. Зрелые клетки также обладают высокой радиорезистентностью, но в восстановлении клеточности популяции после действия повреждающего фактора участия не принимают. Таким образом, очевидна необходимость поддержания выживаемости СК после воздействия ИИ и стимуляции их пролиферации и дифференцировки, что может быть достигнуто использованием лекарственных препаратов. Изучение возможности реализации данного эффекта при индивидуальном и совместном парентеральном введении аквакомплекса глицеросольвата титана (АГТ) и дерината, явилось целью настоящего исследования. В настоящее время АГТ применяется в качестве местного радиопротекторного и противовоспалительного средства, деринат - репаранта и иммуномодулятора.
Материалы и методы исследования. Исследование было проведено на 48 крысах линии wistar, подвергнутых однократному тотальному g-облучению дозой 3 гр и разделенных на группы в соответствии с вводимым препаратом и его дозировкой. Препараты АГТ 2,5 г/кг; АГТ 1,0 г/кг; АГТ 0,1 г/кг внутрибрюшинно; деринат 1 мг/кг внутримышечно; АГТ 1,25 г/кг внутрибрюшинно и деринат 0,5 мг/кг внутримышечно совместно; физиологический раствор 1 мл внутрибрюшинно (контрольная группа) вводились через 1 час после облучения. Через 24 часа после введения препаратов производилась аутопсия фрагмента тощей кишки и костного мозга из бедренной кости с последующим изготовлением гистологических и цитологических препаратов соответственно. С целью определения уровня апоптоза на основании феномена экстернализации фосфатидилсерина препараты окрашивались annexin-v fitc и акридином оранжевым.
Для расчета пролиферативного уровня клеток окрашивание препаратов производилось гематоксилин-эозином (срезы тощей кишки) и азур-эозином (мазки км). Рассчитывался индекс пролиферации-элиминации (ИПЭ), равный отношению митотического индекса (МИ) к апоптотическому (АИ), который служил мерой количественного анализа динамики клеточной популяции.
Сравнение данных ИПЭ, полученных в процессе эксперимента проводилось с показателем ИПЭ в «стабильной» клеточной популяции, в которой на 1 митотически делящуюся клетку приходится 1 клетка, погибающая апоптозом (ИПЭ=1).
Результаты исследования. Анализ клеточных популяций костного мозга и эпителия тощей кишки, произведенный через 25 часов после воздействия ИИ позволяет относить процессы пролиферации и программированной клеточной гибели к стволовым клеткам, поскольку пик апоптотической гибели высоко-радиочувствительных клеток приходится на промежуток времени 3-6 часов после облучения, некротическая гибель клеток происходит в момент облучения и первые минуты после его прекращения.
В процессе эксперимента выявлен антиапоптогенный эффект АГТ, проявляющийся при введении препарата в дозах 2,5 и 1,0 г/кг на ск эпителия энтеродермального типа (АИ 9,44±0,63 и 11,39±0,99); в дозе 2,5 г/кг на гемопоэтические ск (АИ 4,46±0,34, при достоверности различий данных с контрольной группой p<0,05 во всех случаях). Деринат также оказал антиапоптогенный эффект на криптальные ск (АИ 9,58±0,32, p<0,05). Совместное введение АГТ и дерината вызывало некоторое усиление митотической активности клеток и снижение уровня апоптоза, статистически достоверно которое лишь для ск эпителия тощей кишки (АИ 10,12±0,56, p<0,05). Между тем, динамика всех изученных клеточных популяций имеет достоверно значимую тенденцию к росту, что отмечается только при совместном введении АГТ и дерината (ИПЭ 0,51±0,05 и 0,39±0,06 для криптальных и гемопоэтических ск соответственно, при p<0,05), тогда как в отсутствие терапии ИПЭ составил 0,41±0,04 и 0,26±0,04 соответственно.
Механизм антиапоптогенного действия АГТ, вероятно, заключается в том, что микроэлемент титан, входящий в его состав может взаимодействовать с цитохромом с, содержащим в своей структуре химически близкородственный титану элемент - железо. Цитохром с является необходимым фактором для реализации каспаз-зависимого пути индукции апоптоза, под действием индукторов апоптоза через каналы (bax-bax димеры) в наружной мембране митохондрий выходит в цитоплазму, где связывается с белком apaf-1; данный комплекс подвергается олигомеризации с образованием апоптосомы, которая необходима для активации вначале инициирующих, а затем эффекторных каспаз (каспазы 9 и 3 соответственно). При выходе цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму ослабевают связи атома железа с белком (аминокислотами гистидин-18 и метионин-80), а при накоплении в цитоплазме большого количества химически близкородственного, но более реакционно-способного титана, вероятно, возможна замена атома железа на атом титана в структуре цитохрома с, что инактивирует его как апоптогенный фактор. В таком случае, иммортализация клетки является временной, так как экзогенный титан элиминируется из организма (через 24 часа после введения АГТ - на 52%), а цитохром с выходящий из митохондрий при продолжении действия индукторов апоптоза остается интактным и способным к взаимодействию с apaf-1 и активации каспаз. Таким образом, клетка, в которой произошла индукция апоптоза, получает определенное время на устранение генетической нестабильности (ферменты репарации инактивируются только после активации инициирующих каспаз), становится мишенью репаранта (деринат). Однако если генетическая нестабильность будет сохраняться, программа апоптоза будет реализована.
С целью подтверждения гипотезы был проведен эксперимент. Анализировалось содержание свободного фотометрически-определяемого железа в растворе при инкубации смеси цитохрома c и АГТ в соотношении чистых веществ 1:300 (соотношение исходных растворов цитохрома c (0,25%) и АГТ (50%) 1:1,5), что приближенно соответствует соотношению цитохрома c и АГТ в цитоплазме клеток при введении последнего в дозе 2,5 г/кг. Инкубация проводилась при температуре 37°с в течение 24 часов. Кроме того, оценивалось содержание свободного железа в растворах цитохрома c и АГТ.
Концентрация свободного железа в 0,25% растворе цитохрома c составила 32,72±2,60 мкмоль/л, что обусловлено наличием прочных связей атома железа с элементами гемовой структуры и белка. С титаном, входящим в состав АГТ реактив «iron e-fl» дает перекрестную реакцию с образованием окрашенного продукта и концентрацией свободного металла в растворе 53,80±2,73 мкмоль/л.
Выявлено, что концентрация свободного металла в растворе при инкубировании цитохрома c и АГТ, определенная фотометрически (58,05±2,54 мкмоль/л) достоверно выше расчетной концентрации, т.е. Алгебраической суммы концентраций железа в растворах цитохрома c и АГТ с учетом их соотношения (45,37±2,06 мкмоль/л при p=0,003). Прирост концентрации, очевидно, обусловлен выходом в раствор свободного железа как продукта реакции титана с цитохромом c. Данный факт доказывает наличие взаимодействия между АГТ и цитохромом c, с вытеснением железа из структуры последнего.
Механизм протекторного действия экзогенных нуклеиновых кислот, в том числе, дерината после воздействия ионизирующего излучения не изучен. Однако представляется возможной реализация терапевтического действия дерината следующими путями. Деринат по химической природе является полидезоксинуклеотидом, аналогичным полидезоксинуклеотидам (растворимым фрагментам хроматина), выходящим из клеток, погибающих под воздействием ии и являющимся одним из продуктов распада ядерного материала интерфазно гибнущих клеток. Являясь продуктом клеточного распада, полидезоксинуклеотиды, вероятно, способны увеличивать радиорезистентность клеток, а также стимулировать их пролиферацию, что является компенсаторным механизмом на фоне прогрессирующей элиминации клеток. Кроме того, дезоксирибонуклеат натрия, поступивший в организм и подвергшийся деградации под действием днказ, пополняет пул нуклеотидов, необходимых для осуществления процессов репарации и репликации днк.
Выводы:
1. Аквакомплекс глицеросольвата титана проявляет выраженный антиапоптогенный эффект, реализующийся, вероятно, через инактивацию цитохрома c и ингибирование каспаз-зависимого пути индукции апоптоза, что открывает возможности динамического воздействия на процесс программированной клеточной смерти;
2. Совместное использование АГТ и дерината способствует позитивной тенденции в восстановлении клеточной популяции радиочувствительных тканей после воздействия повреждающего фактора путем стимуляции репарации повреждений ДНК и поддержания выживаемости стволовых клеток;
3. Исследуемая комбинация препаратов может быть предложена для снижения апоптотичекой гибели СК в культуре через блокаду одного из альтернативных (каспаз-зависимого) путей индукции апоптоза.
См. также:
Продолжительное гамма-облучение в низких дозах увеличивает число стромальных клеток-предшественников (КОЕ-Ф) в костном мозге мыши
Патогенетическое обоснование применения фетальных клеток человека
Исследование влияния различных модификаций коллаген-хитозановых матриц на эффективность заживления ожогов у крыс как этап создания подложек для культивирования и направленной дифференцировки стволовых клеток
Апробация сочетанного применения аутологичных мезенхимных стволовых клеток и остеотропного материала для лечения пародонтита
Результаты клинического применения гибридных имплантатов для коррекции осложнений диабета
Оптимизация условий культивирования стромы костного мозга человека, обогащенной стволовыми клетками и опыт ее клинического применения при боковом амиотрофическом склерозе
Терапия ишемического инсульта головного мозга у крыс с помощью мезенхимных стволовых клеток
Влияние сроков трансплантации МСК на эффективность терапии экспериментального инсульта головного мозга
Аутологичные фибробласты в косметологии
Влияние искусственных поверхностей на остеогенную дифференцировку пула мезенхимальных стромальных клеток костного мозга in situ
...
Обсудить на форуме
