Еремеев А.В., Замай А.С.
(Центр репродуктивной медицины, 660037; г. Красноярск, ул. Коломенская, 26, e-mail: art-eremeev@yandex.ru)
Проблема восстановления раневых дефектов была и остается одной из самых актуальных проблем современной медицины. В мире существует большое количество новых раневых покрытий (на основе хитозана и коллагена, таких как «Тимохитон» - Насибов С.М. № ИФ-16/34-95 НИИ физико-химической медицины МЗ РФ Москва, 1996.; «Коллахит» (RU 2108114 (13) С1; А61 L 15/28 от 10.04.98 Бюл. №10; на основе альгината натрия - Чумаков А.А., Комнова З.Д. 1984.; Чумаков А.А., и др. 1985), однако пока не удается создать универсальную матрицу обладающую следующими свойствами - не оказывать пирогенного, токсического, раздражающего воздействия на окружающие ткани; обладать биосовместимостью; создавать оптимальную микросреду для регенерации раны; обладать абсорбционной способностью в отношении раневого экссудата; предотвращать проникновение и развитие микроорганизмов; быть проницаемым для паров воды и воздуха, но не высушивая при этом дна раны; быть эластичным; моделировать поверхность со сложным рельефом.
В настоящее время важной задачей является разработка способов и средств, ускоряющих сроки безрубцового заживления. Использование природных полимеров, способных осуществлять контроль синтеза и ориентации волокнистых структур таких полимеров в комбинации с мукополисахаридами и факторами роста и клетками, антиоксидантами позволит контролировать гранулирование, эпителизацию кожных дефектов, уменьшать воспаление, получать нежную высоко косметическую рубцовую ткань, мало отличающуюся от окружающей здоровой.
Ранее нами была показана возможность создания матрицы (раневого покрытия Коллахит-Бол) на основе коллаген-хитозанового комплекса для культивирования фибробластов приближенной по свойствам к «идеальной» (патент РФ № 2252787 от 27.05.2005). Однако, использование рекомбинантных факторов роста при добавлении в матрицу не только значительно увеличивает ее стоимость, но также увеличивает возможность иммунного ответа на чужеродный белок. Известно, что культивируемые клетки секретируют в среду различные факторы (в том числе и ростовые), поддерживающие пролиферативную активность или дифференцированное состояние. Использование кондиционированной клетками среды в качестве добавки к матрице может помочь избежать вышеуказанных проблем и дать предпосылки для создания подложек для культивирования клеток разных типов, в том числе и стволовых.
Цель настоящей работы - модифицировать состав существующей матрицы на основе коллаген-хитозанового комплекса с помощью среды, кондиционированной эмбриональными фибробластами человека и сравнить эффективность заживления ожогов при его использовании с имеющимися аналогами. При положительном эффекте планируется создать матрицы для направленной дифференцировки и культивирования плюрипотентных клеток.
При моделировании ожогов IIIа степени, под тиопенталовым наркозом проводили прижигание межлопаточной области специальным клеймом площадью 55 мм2 крысам в течение 15 секунд при температуре 200°С. На поверхность раны наносили различные варианты раневых покрытий, которые фиксировали пластырем.
Через 3 дня, а затем через 7 и 13 и 23 дня животных забивали под наркозом. Определяли площадь ожога, состояние ожоговой раны и матрицы (цвет, зоны воспаления, грануляцию), проводили забор крови для определения общих биохимических показателей, экстракцию клеток из раны для определения их физиологического состояния, а также получали образцы ткани раневой и околораневой поверхности для гистологического анализа структуры ткани и оценки эффективности полноценной регенерации.
Рис.1 Схема получения кондиционированной среды
В ходе работы получено, что через 7 дней скорость оседания эритроцитов (СОЭ) значительно снизилась, а на 13 день была практически как у контрольной группы (рис.2а). Через 23 дня площадь ожога у крыс, пролеченных повязками со средой, уменьшилась до 0,3 мм2 (рис.2б), при этом, внутренняя граница ожоговой раны практически не была видима.
Морфологический анализ показал, что в ожоговой зоне при применении раневого покрытия «Коллахит-Бол» с включенными мукополисахаридами и сывороточным фактором роста, кондиционированной средой и цистеином, полностью восстанавливается подкожный соединительнотканный комплекс к 13-му посттравматическому дню (рис.3, 6).
Данная композиция приводит к образованию соединительной ткани, в объеме равному нормальному ее содержанию, а также восстанавливает объем сосудов, превышающий показатели группы животных, леченных матрицами без добавления среды и цистеина. В сосочковом слое собственно кожи полностью восстанавливается объем коллагеновых волокон, а ретикулярные волокна имеют диаметр, соответствующий аналогичному слою интактной кожи. При этом отмечается отсутствие клеточно-воспалительной реакции в околорубцовой зоне сосочкового слоя. В сетчатом слое дермы регистрируются более толстые ретикулярные волокна, чем в группе, где применяли раневое покрытие без дополнительных добавок, что указывает на их зрелость в момент отпадения первичного струпа. Волокнистые элементы всех слоев представленной зоны имеют направление, схожее со строением интактной кожи.
В зоне рубца при использовании коллаген-хитозановой конструкции с добавками полностью восстанавливается объем кровеносных сосудов, и их показатели превосходят данные, где применяли для заживления раневого дефекта покрытие без них (рис.4).
Лучшая васкуляризация способствует более раннему закрытию раневого дефекта с образованием зрелой соединительной ткани, близкой к строению нормальной кожи. Также в этой группе отмечается образование сосочкового слоя в зоне рубца к 13 суткам посттравматического периода с наличием зрелых ретикулярных и коллагеновых волокон и отсутствием воспалительной реакции. Сетчатый слой рассматриваемой зоны толщиной, соответствующей нормальному строению аналогичного участка кожи, имеет больший объем ретикулярных и коллагеновых волокон, причем количество последних соответствует интактной коже. Клеточно-воспалительная реакция в группе крыс, где использовали раневое покрытие «Коллахит-Бол» с добавками не выражена, чем в рубцовой зоне при лечении раневой композицией без них. При этом во всех слоях отмечается более плотная укладка волокнистых элементов, а ход волокон строго ориентирован поперечно оси тела и перпендикулярно друг другу.
Полное восстановление кровеносных сосудов в зоне рубца приводит к раннему созреванию, в объеме, равном интактной коже, коллагеновых и ретикулярных волокон, как в сосочковом, так и в сетчатом слоях дермы (рис. 5)
В контрольной группе животных лечение ран, которых осуществлялось наложением увлажненной физраствором матрицы, морфологическая картина новообразовавшейся соединительной ткани характеризуется отсутствием подкожного соединительнотканного комплекса, недостаточным развитием кровеносных сосудов в околорубцовой зоне и зоне рубца, присутствием в малом количестве тонких ретикулярных волокон и толстых коллагеновых волокон в обоих исследуемых участках. Причем волокнистые структуры к 13-м суткам посттравматического периода не имеют четкой направленности, характерной для соединительной ткани кожного покрова. При этом как в околорубцовой, так и в рубцовой зонах, к моменту заживления кожного дефекта регистрируется яркая картина клеточно-воспалительной реакции.
Таким образом, получены аналоги искусственной кожи путем естественного электростатического взаимодействия отдельных ее компонентов, способные контролировать в обширном раневом дефекте пролиферацию и секрецию фибробластов, образование трехспиральной структуры коллагена с формированием строго ориентированных коллагеновых волокон при ожоговом воспалении, раневого гранулирования и эпителизации, косметического («безрубцового») закрытия раны. Полученные данные указывают на возможность создания подложек для культивирования и дифференцировки клеток, в том числе и стволовых.
Руководитель: Центр репродуктивной медицины, директор, к.м.н. Светлаков А.В.,
Консультанты: Красноярский научный центр, к.б.н. Моргулис И.И., Сибирский федеральный университет, к.б.н. Замай Т.Н.
См. также:
Продолжительное гамма-облучение в низких дозах увеличивает число стромальных клеток-предшественников (КОЕ-Ф) в костном мозге мыши
Патогенетическое обоснование применения фетальных клеток человека
Перспектива использования аквакомплекса глицеросольвата титана и дерината с целью увеличения выживаемости и поддержания пролиферативного потенциала стволовых клеток радиочувствительных тканей после воздействия ионизирующего излучения
Апробация сочетанного применения аутологичных мезенхимных стволовых клеток и остеотропного материала для лечения пародонтита
Результаты клинического применения гибридных имплантатов для коррекции осложнений диабета
Оптимизация условий культивирования стромы костного мозга человека, обогащенной стволовыми клетками и опыт ее клинического применения при боковом амиотрофическом склерозе
Терапия ишемического инсульта головного мозга у крыс с помощью мезенхимных стволовых клеток
Влияние сроков трансплантации МСК на эффективность терапии экспериментального инсульта головного мозга
Аутологичные фибробласты в косметологии
Влияние искусственных поверхностей на остеогенную дифференцировку пула мезенхимальных стромальных клеток костного мозга in situ
...
Обсудить на форуме
