Кривошеина О.И., Запускалов И.В., Хлусов И.А. 1
(Сибирский государственный медицинский университет; 634050, г. Томск, ул. Московский тракт 2;
1 - ООО “СибМедАналит“, г. Томск; khl@ultranet.tomsk.ru)
Накапливаются работы о способности стволовых клеток взрослого организма к дифференцировке в клетки не только тканей их существования, но и многих других, что привело к интенсивному развитию и внедрению клеточных технологий в клиническую медицину. Трансплантация стволовых и родоначальных клеток, выделенных из аутологичных тканей или крови, апробируется при заболеваниях центральной и периферической нервной системы, сердечно-сосудистой патологии, эндокринных нарушениях, патологии сетчатки и зрительного нерва [1-4]. Однако, результаты подобных исследований подчас являются неопределенными и неубедительными, отрицательные же последствия во многих случаях умалчиваются.
Целью настоящей работы стало изучение in vitro влияния направленного потока жидкости на морфофункциональное состояние стромальных прекурсоров, циркулирующих в периферической крови человека.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Разработано оригинальное устройство - биореактор in vitro, позволяющее моделировать направленное движение питательной среды. Устройство представляет собой замкнутую систему с камерой, содержащей полупроницаемый фильтр. Система предварительно заполнялась питательной средой, содержащей 80% cреды McCoy 5A, 20% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицин (из расчета 0,02 мл на 10,0 мл среды). Мононуклеары периферической крови здоровых доноров-добровольцев выделяли с помощью градиента фиколл-верографин. Полученные клетки доводили питательной средой до конечной концентрации 3?106 нуклеаров/мл. Клеточный материал вводили в камеру и помещали на фильтр. Камера соединялась с емкостью через роликовый насос, благодаря работе которого в замкнутой системе создавалось равномерное направленное движение питательной среды со скоростью 2,1-2,4 мм3/мин. Первичную клеточную культуру инкубировали при постоянном движении жидкой питательной среды с соблюдением условий культивирования.
В качестве контроля изучаемые клетки культивировали в стационарной культуре на полупроницаемом фильтре, помещенном в чашку Петри с необходимой питательной средой, при строгом соблюдении температурного режима (37° С), содержания СО2 (5-7%) и уровня влажности (100%).
Длительность культивирования составила 24, 48 и 72 часа. По окончании экспериментов клеточный материал, находящийся на полупроницаемом фильтре, исследовали с помощью цитохимических и гистологических методов. Просмотр и фотографирование клеточного материала производили с помощью рабочего места морфолога, включающего персональный компьютер IBM PC Pentium, цифровой фотоаппарат EPSON и микроскоп фирмы Karl Zeiss- Yena. Методом компьютерной морфометрии цифровых изображений, с использованием программы PhotoShop 6.0, определяли в условных единицах оптическую плотность (у.е.о.п.) адгезированных к фильтру мононуклеарных клеток.
Статистическую обработку проводили с применением непараметрического U-критерия Манна-Уитни (pU).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Через 24 ч от начала эксперимента культура мононуклеаров на фильтре была представлена прочно адгезированными к субстрату клетками округлой формы, с базофильной цитоплазмой и крупным ядром, имеющим иногда зубчатое впячивание. Ядерно-цитоплазматическое отношение около 1. Цитохимически (табл. 1) в клетках отмечалась высокая активность ?-нафтилацетатэстеразы, которая блокировалась фторидом натрия. Щелочная фосфатаза в культивируемых клетках не выявлялась.
Спустя 48 ч (табл. 1, 2) в описываемых клетках отмечалось повышение активности ?-нафтилацетатэстеразы по сравнению с исходными показателями и клетками, культивируемыми в стандартных условиях (pU<0,01). При проведении реакции с фторидом натрия на фильтре обнаруживались единичные элементы, в которых активность неспецифической эстеразы не подавлялась, а также выявлялась умеренная активность щелочной фосфатазы.
Таблица 1. Цитохимическая активность мононуклеаров крови при проточном культивировании in vitro (у.е.о.п.), X, pU.
Примечание: статистически значимые различия отмечены (p0<0,01) при сравнении с исходными показателями; (p1<0,01) при сравнении с показателями в динамике эксперимента.
Через 72 ч культуры клеток на фильтре состояли, главным образом, из макрофагов с пенистой, содержащей вакуоли цитоплазмой, и лимфоцитов. Ядро почковидной или округлой формы с зубчатым впячиванием. Ядерно-цитоплазматическое отношение менее 1. Среди лимфоцитов и макрофагов обнаруживались единичные, крупных размеров клетки неправильной, преимущественно, веретенообразной формы. Цитохимически в указанных клетках отмечалась более высокая активность ?-нафтилацетатэстеразы по сравнению с показателями через 48 ч и клетками, выращиваемыми в стандартных (стационарных) условиях (pU<0,01; табл. 1, 2). Активность неспецифической эстеразы не подавлялась фторидом натрия. В подобных клетках отмечалось также усиление активности щелочной фосфатазы по сравнению с показателем через 48 ч от начала эксперимента (pU<0,01; табл. 1). Морфологические и цитохимические параметры указанных клеток соответствовали активно синтезирующим фибробластам.
При культивировании мононуклеаров периферической крови в стандартных (стационарных) условиях на протяжении всей серии экспериментов клеточная культура на фильтре была представлена клетками округлой формы, с бобовидным или круглым ядром с зубчатым впячиванием. Ядерно-цитоплазматическое отношение около или менее 1. Цитохимически в клетках отмечалась умеренная активность ?-нафтилацетатэстеразы, которая постепенно повышалась в процессе культивирования (pU<0,05; табл. 2), что связано с дифференцировкой моноцитов в макрофагальные клетки. Активность неспецифической эстеразы ингибировалась фторидом натрия. Щелочная фосфатаза в культивируемых клетках не выявлялась.
Таблица 2. Сравнительная характеристика активности a-нафтилацетатэстеразы мононуклеаров крови при культивировании in vitro в различных условиях (у.е.о.п.), X, pU.
Примечание: статистически значимые различия отмечены (p0<0,01) при сравнении с результатами культивирования в стандартных условиях; n -количество подсчитанных клеток.
Таким образом, при культивировании мононуклеаров периферической крови человека в условиях направленного движения питательной среды (биореактор in vitro) отмечается повышение их внутриклеточной ферментативной активности. При модулирующем влиянии факторов микроокружения (направленный поток жидкости, внеклеточный матрикс) ускоряется процесс дифференцировки моноцитов в макрофаги, а обнаруживаемых среди мононуклеаров стромальных прекурсоров - в зрелые, коллагенсинтезирующие формы.
Полученные данные позволяют существенно расширить представления о влиянии физических факторов микроокружения на морфофункциональное состояние молодых мезенхимальных клеток и возможность реализации их фиброгенного потенциала при проведении клеточной терапии.
Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ для молодых российских ученых за 2006-2007 гг. № МД - 6837.2006.7.
ЛИТЕРАТУРА
1. Пак Н.В., Ченцова Е.В., Зуева М.В. // Вестн. офтальмологии.- 2004.- № 6.- С. 21-24.
2. Шумаков В.И., Онищенко Н.А. // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 2003.- Т. 135, № 4.- С. 461-465.
3. Chierchia S. // Ital Heart J.- 2004.- Vol. 5 (Suppl 6).- P. 108-115.
4. Radner W. // Invest Ophthalmol Vis Sci.- 2002.- Vol. 43.- P. 3053-3058.
См. также:
Аутологичные фибробласты в косметологии
Влияние искусственных поверхностей на остеогенную дифференцировку пула мезенхимальных стромальных клеток костного мозга in situ
Аллогенные клеточные трансплантации пренатальных и постнатальных мультипотентных стромальных клеток в лечении хронической сердечной недостаточности у пациентов с дилатационной кардиомиопатией
Стволовые потенции перисинусоидальных клеток Ито
Биохимические и морфологические изменения в печени больных хроническим гепатитом после трансплантации аутологичных стволовых кроветворных клеток (1-я фаза клинических исследований)
Проблемы государственного регулирования в сфере клеточных технологий
Использование аутологичных мезенхимальных стволовых клеток в лечении возрастной макулярной дегенерации
Разработка методов применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток (МСК), получаемых из них кардиомиобластов, а также кондиционной среды из-под МСК при терапии различных заболеваний
Влияние сроков трансплантации мезенхимных стволовых клеток на репарацию сердечной мышцы крыс после инфаркта
Репарация костной ткани с помощью мезенхимных стволовых клеток
...
Обсудить на форуме
