Карлов А.В., Хлусов И.А., Gil Rosenman1, Daniel Aronov1, Дружинина Т.В.
(Томский филиал Российского научного центра “Восстановительная травматология и ортопедия” им. акад. Г. А. Илизарова Росздрава; 634059, Томск, а/я 1029; khl@ultranet.tomsk.ru; 1School of Electrical Engineering, Department of Physical Electronics, Tel-Aviv University, Israel)
Остеогенные свойства гидроксилапатита и трикальцийфосфата, составляющих основу минерального матрикса кости, убедительно доказаны феноменом эктопического костеобразования, когда на поверхности кальцийфосфатных (КФ) материалов формируется костная ткань. Одним из первых описал данный феномен Urist (1965).
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки способны дифференцироваться в остеоциты, хондроциты, фиброциты, адипоциты, нервные клетки, миоциты и стромальные клетки, способные поддерживать гемопоэз. Однако, остается неясным выбор линии дифференцировки в условиях многоклеточных систем.
Различные образцы КФ материалов, в зависимости от физико-химических свойств (степень кристалличности и пористости, растворимость, шероховатость поверхности и т.д.), обладают разной способностью поддерживать костеобразование. До сих пор не удалось найти ключевое сочетание их структуры, толщины и скорости растворения для реализации остеогенного потенциала пула мезенхимальных стромальных клеток (ПМСК).
В связи с этим, комплексное значение физико-химических параметров поверхности КФ материалов в регуляции дифференцировки пула стромальных прекурсоров представляло как теоретический, так и практический интерес.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В экспериментах использовались 62 мыши-самца линии BALB/c. 49 животному под эфирным наркозом подкожно вводили по 1 имплантату (диаметр 12 мм, толщина 1 мм) с нанесенным в асептических условиях столбиком сингенного костного мозга (средняя площадь мозга 7,5 мм2), взятого из бедренной кости. Для адгезии клеток органную культуру костного мозга на подложке культивировали в течение 45 мин в культуральной среде, содержащей 95% среды RPMI-1640 (ICN) и 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ICN). Костный мозг служил источником ПМСК и ростовых факторов. При раздельном подкожном введении мышам подложек и фрагментов костного мозга образования тканевых пластинок не наблюдалось.
Через 45 суток имплантаты извлекали. Для проведения гистологического анализа тканевых пластинок применяли стандартные методы световой микроскопии тонких срезов.
В качестве подложек применяли диски из медицинского титана. Искусственные биосовместимые (бионертное и кальцийфосфатные) поверхности формировали на дисках с использованием микро- и наночастиц гидроксилапатита (ГАП) при помощи модификаций анодно-искрового (микродугового) оксидирования и шликерного метода.
Электронную обработку КФ поверхностей проводили пушкой Kimball Physics Inc (США) в вакууме 10-7 тор с постоянной энергией возбуждения 100 еВ и плотностью тока электронов 100 нА/см2 в интервале времени 2 с - 24 ч.
Морфологию поверхности биосовместимых покрытий, их элементный и фазовый состав выявляли методом растровой электронной микроскопии (SEM), микрорентгеноспектрального анализа (MRSA), рентгенофазового анализа (XRD), атомно-силовой микроскопии (AFM). Измеряли толщину и шероховатость покрытий (согласно ГОСТ 2789-73).
Статистическую обработку данных проводили с применением непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни (Pu). Корреляционный анализ выполняли согласно коэффициенту корреляции рангов Спирмена (r).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В настоящее время in vitro достигнуты значительные успехи в индукции дифференцировки ПМСК в различных направлениях, демонстрирующие широкие возможности для проведения клеточной терапии. Тем не менее, добиться реализации необходимого потенциала стромальных прекурсоров in vivo гораздо труднее. На наш взгляд, во многих случаях решением проблемы является scaffold-технология, позволяющая целенаправленно создавать для ПМСК специфическое микроокружение. В частности, для остеогенных клеток подобным носителем являются КФ материалы.
Физико-химическое тестирование позволило условно выделить следующие группы биосовместимых поверхностей: 1) Металлокерамическое (МК), кальцийфосфатное плотное (КФП) рентгеноаморфное, КФП кристаллическое покрытия можно определить как гладкие (6-8 классы шероховатости), дефицитные по кальцию (атомное соотношение кальций/фосфор менее 1,67, характерное для стехиометрического гидроксилапатита), тонкие, мелкопористые (диаметр пор менее 50 мкм); 2) кальцийфосфатное рыхлое (КФР) рентгеноаморфное, КФР кристаллическое - шероховатые (4-5 классы шероховатости), дефицитные по кальцию, толстые (толщина более 50 мкм), мелкопористые (диаметр пор менее 50 мкм); 3) кальцийфосфатное стеклокерамическое (КФС) - нестехиометрическое (Ca/Pат > 1,67), толстое, макропористое (диаметр пор около 200 мкм).
Исследование реакции тканей показало, что через 45 суток после подкожной имплантации изучаемых подложек, несущих сингенный костный мозг, не отмечалось признаков воспалительной реакции ни в одной из групп наблюдения. Следует отметить высокую биосовместимость имплантатов, вызывающих только слабую инкапсуляцию, говорящую о незначительной реакции подкожной клетчатки на их введение. На различных искусственных поверхностях были выявлены различного размера участки костного мозга, жировая ткань, рыхлая неоформленная соединительная ткань с элементами оссификации, костная ткань. Наличие остеобластов говорило об активном формировании костной ткани (рис.1).
Рис.1. Погружение остеобластов в костный матрикс при формировании костной ткани на кальцийфосфатных поверхностях. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение 400.
Таким образом, биотесты показали, что КФ поверхности с “примитивным” физико-химическим составом, не соответствующим таковому в кости, активно влияют на функциональные свойства ПМСК.
Остеоиндуцирующим потенциалом обладают 4 из 6 исследованных нами КФ покрытий, характеризующихся выраженной шероховатостью либо макропористостью поверхности. Максимальной (100%) вероятностью индукции остеогенеза обладали КФР и КФС искусственные поверхности. В меньшей степени остеогенный потенциал реализовали КФР кристаллические (67%) покрытия.
В связи с этим, была предпринята попытка статистически прояснить важнейший вопрос: какие свойства поверхности являются определяющими для адгезии, миграции и остеогенной дифференцировки ПМСК, приводящей к метаплазии костного мозга и соединительной ткани в зрелую кость. Корреляционный анализ позволил выявить дифференциальное значение физических и химических параметров искусственных поверхностей для регуляции дифференцировки пула стромальных клеток in situ: а) адгезия клеток костного мозга является начальным этапом, определяющим в дальнейшем их кондукцию по искусственной поверхности (площадь формирующейся тканевой пластинки). Успех гистогенеза зависит от шероховатости поверхности. Оптимальным является 4-5 класс шероховатости согласно ГОСТ, что в условиях специфического микроокружения позволяет родоначальным стромальным клеткам дифференцироваться в соединительную и жировую ткани.
Очаги активного кроветворения (рис.1) подразумевают также дополнительную дифференцировку ПМСК в стромальные клетки, формирующие гемопоэзиндуцирующее микроокружение; б) прилипание и продвижение по поверхности имплантата стромальных клеток (в том числе остеогенных) является необходимым, но недостаточным условием для их дифференцировки в костную ткань.
Индукция остеогенного потенциала стромальных прекурсоров (остеоиндукция) определяется соотношением в покрытии атомов кальция и фосфора. Наличие гидроксилапатита (атомное соотношение Ca/P=1,67) не является обязательным условием для костеобразования. В предложенной экспериментальной системе только при Ca/P<0,5 блокируется дифференцировка ПМСК в остеогенном направлении; в) эктопический остеогенез успешнее протекает на “толстых” подложках. Минимальная толщина КФ слоя должна составлять 50-80 мкм.
В случае формирования КФ покрытий на титановых подложках из нанофракции (30-50 нм) ГАП рельеф поверхности практически не отличался от такового при использовании микрочастиц ГАП. Тем не менее, вероятность формирования костной пластинки составляла всего 12,5% (1 случай из 8). В остальных случаях вырастает рыхлая неоформленная соединительная ткань.
Интересным и малоизученным оказался тот факт, что дополнительная обработка наноструктурных КФ покрытий пучком электронов усиливала в несколько раз кондукцию клеток костного мозга по поверхности. При этом формировались замкнутые с 2-х сторон костные пластинки, между которыми располагается красный костный мозг. Вероятность образования костной ткани (остеоиндукция) достигла 100%.
Пул стволовых и коммитированных клеток представляет собой гетерогенную популяцию, находящуюся под контролем дистантных и локальных регуляторных механизмов. В любой ткани выделяют структурно-функциональную единицу (микрорегион), включающую специализированные клетки, элементы стромы, сосуды микроциркуляции и терминальные нервные окончания. Результаты показывают, что к микроокружению стромальных клеток относятся не только органические, но и вполне определенные количественные и качественные физико-химические параметры, локальное или системное изменение которых может влиять на их функциональную активность.
Работа выполнена при поддержке гранта NMP3-CT-2003-504937 6-й рамочной программы Европейской комиссии.
См. также:
Результаты клинического применения гибридных имплантатов для коррекции осложнений диабета
Оптимизация условий культивирования стромы костного мозга человека, обогащенной стволовыми клетками и опыт ее клинического применения при боковом амиотрофическом склерозе
Терапия ишемического инсульта головного мозга у крыс с помощью мезенхимных стволовых клеток
Влияние сроков трансплантации МСК на эффективность терапии экспериментального инсульта головного мозга
Аутологичные фибробласты в косметологии
Аллогенные клеточные трансплантации пренатальных и постнатальных мультипотентных стромальных клеток в лечении хронической сердечной недостаточности у пациентов с дилатационной кардиомиопатией
Стволовые потенции перисинусоидальных клеток Ито
Биохимические и морфологические изменения в печени больных хроническим гепатитом после трансплантации аутологичных стволовых кроветворных клеток (1-я фаза клинических исследований)
Проблемы государственного регулирования в сфере клеточных технологий
Использование аутологичных мезенхимальных стволовых клеток в лечении возрастной макулярной дегенерации
...
Обсудить на форуме
