Докторов А.А., Денисов-Никольский Ю.И., Воложин А.И., Лосев Ф.Ф., Терехов С.М., Татаренко-Козьмина Т.Ю., Жилкин Б.А., Матвейчук И.В., Мальгинов Н.Н., Тетюхин Д.В., Вольперт У. В., Фролова Е.Н., Янушевич О.О.
(НИЦ Биомедицинских технологий (ВИЛАР), ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» (МГМСУ); e-mail: ttatarenko@mail.ru)
Введение. В медицинской практике часто требуются реконструктивные операции на костных структурах с применением имплантатов. Наибольший интерес представляют биоактивные пористые деградируемые материалы, сохраняющие достаточную механическую прочность в процессе их замещения костной тканью. По нашим данным особенно перспективны материалы, в состав которых введен гидроксиапатит [1]. В реальности же восстановление естественной структуры кости часто не успевает за деградацией искусственного матрикса. Поэтому, в настоящее время значительное распространение получили не деградируемые материалы.
Взаимодействие костных структур с материалом имплантата определяется его химическими свойствами, характеристиками микрорельефа и смачиваемостью поверхности. Для увеличения остеоинтегративных свойств этих материалов исследователи предлагают многочисленные варианты реконструкции их поверхности. При этом задачами обработки являются получение поверхностного слоя костеподобного апатита, уменьшение выделения ионов вещества в ткани, отсутствие цитотоксичности, увеличение адгезии клеток, высокая активность связывания протеинов. Использование мезенхимальных стволовых клеток (МСК) взрослых в тканевой инженерии позволяет придавать остеоиндуктивные свойства материалам, таковыми в обычных условиях не обладающими. Необходимым условием, обеспечивающим их функционирование, является высокая плотность культуры на носителях [3]. В травматологии и челюстно-лицевой хирургии сейчас наиболее широкое распространение получили имплантаты на основе сплавов благородных или просто биоинертных металлов: титана и его сплавов, циркония, золота, платины. Титан и цирконий существенно отличаются от других металлов тем, что на их поверхности спонтанно образуется оксидный слой, на основе которого в свою очередь формируются фосфаты кальция. Таким образом, титан можно рассматривать как биоактивный материал. скрининг материалов, как правило, проводят на клеточных культурах остеобласт-подобных клеток и МСК. При этом обычно прослеживают пропорциональность активности первичной адгезии и распластывания клеток на поверхности материала (до 24 часов) дальнейшей экспрессии маркеров остеогенеза [2]. Считается, что при прочих равных условиях увеличение шероховатости поверхности усиливает адгезию, пролиферацию и фенотипическую экспрессию остеобластов.
Задачей данной работы было определение цитотоксичности имплантационных материалов на основе титана и золота, а также их влияния на прикрепление и пролиферацию МСК человека. Тестировали 4 материала: чистый титан марки Grade 4 ASTM F -67-00 (аналог ВТ1-0 ГОСТ 19807-91) c фрезерной обработкой поверхности с шероховатостью Ra 0,63 (1); титан с пескоструйной обработкой поверхности Al2O3 с размером зерна 355-300 мкм (2); титан с плазменным напылением титанового порошка ВТ1-0 с размером зерна 10-20 мкм (3); сусальное золото, ГОСТ 6902 (4).
Методы исследования. В работе применяли клеточные культуры фибробластов кожи и МСК человека. С помощью МТТ-теста, а также прижизненной окраски клеток флуоресцеиндиацетатом и бромистым этидием in vitro оценивали цитотоксичность образцов материалов, а также их влияние на прикрепление и пролиферацию клеток. Во всех случаях контролем служили лунки с клетками без образцов. Окраску акридиновым оранжевым и метод СЭМ использовали для определения морфологии клеток.
Клетки культивировали на среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37°С в условиях насыщающей влажности в атмосфере с 5% СО2. При определении цитотоксичности клетки высевали с плотностью 50 тысяч на лунку, через 24 часа в лунки вносили образцы и инкубировали 72 часа. В экспериментах по определению эффективности прикрепления МСК их высевали по 60 тысяч на образец и культивировали в течение 3 дней. При оценке эффективности пролиферации МСК высевали по 20 тысяч на образец и культивировали в течение 14 дней. В последнем случае оптическую плотность элюата определяли отдельно как для самого образца, так и для лунки, в которой он находился.
Оптическую плотность элюата измеряли на плашечном фотометре «ЭФОС 9305» при длине волны 570 нм. Для сопоставления экспериментальных значений оптической плотности с количеством клеток на образцах была построена калибровочная кривая. С этой целью клетки в известном количестве высевали в лунки 24-х луночного планшета, а на следующий день проводили МТТ-тест.
Для изучения организации клеточного слоя методом СЭМ образцы материалов с клетками фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида и в 2% растворе OsO4, обезвоживали и высушивали в критической точке на аппарате «Hitachi HCP-2». Полученные препараты напыляли медью в атмосфере аргона на приборе «Balzers SCD 040» и исследовали в сканирующем электронном микроскопе «Philips SEM-515».
Результаты.
Поверхность образцов. Рельеф поверхности образцов зависит от способа их обработки (Рис.1). После фрезерования поверхность образца 1 образована параллельными канавками. Неровный, изломанный рельеф образца 2 является следствием пескоструйной обработки. Более сглаженная поверхность с мелкими гранулами в образце 3 отражает напыление титановым порошком. Рельеф образца сусального золота (4) гладкий с неглубокими царапинами и неравномерно расположенными мелкими складками.
Рис.1. Поверхность образцов из титана (1-3) и сусального золота (4). СЭМ. Метка: 0,1 мм.
Цитотоксичность и эффективность прикрепления. При исследовании цитотоксичности для фибробластов кожи и мезенхимальных стволовых клеток человека были получены сходные результаты (Таблица 1). Цитотоксические свойства у изученных материалов не обнаружены.
Результаты определения эффективности прикрепления клеток к поверхности образцов представлены в таблице 2. Все образцы стимулируют пролиферацию МСК: произошло удвоение их популяции, и количество клеток на них превышает таковое в контроле.
Таблица 1. Оценка цитотоксичности исследованных материалов.
Таблица 2. Прикрепление МСК к поверхности образцов.
Эффективность пролиферации МСК. Данные суммированы в таблице 3. На образце 1 произошло троекратное увеличение количества клеток, но эффективность пролиферации оказалась все же ниже, чем на образцах 2-4. При этом суммарное количество клеток на образцах и в лунках превышает таковое в контроле, что может быть связано как с увеличением поверхности, пригодной для роста клеток, так и со стимулирующим действием этих образцов на МСК.
Таблица 3. Эффективность пролиферации МСК.
На поверхности всех образцов МСК многочисленны и расположены в виде параллельных или пересекающихся тяжей. Они имеют вытянутую форму, плотно упакованы и, как правило, располагаются параллельно друг другу. На поверхности клеток выявляется небольшое количество коротких микроворсинок, расположенных с различной плотностью. Нередко встречаются митозы (Рис.2).
Рис.2. МСК на поверхности образцов из титана (А) и сусального золота (Б).
(*) - клетка в состоянии митоза. СЭМ. Метка 10 мкм.
Заключение. Как титан, так и сусальное золото, обладают хорошими адгезивными свойствами для МСК. Пролиферация клеток наиболее активно происходит на образцах из сусального золота. Далее в порядке убывания следуют титан с плазменным напылением, с пескоструйной обработкой и, наконец, с фрезерной обработкой поверхности.
Литература.
1.Воложин А.И., Денисов-Никольский Ю. И., Татаренко-Козьмина Т.Ю., Лосев Ф.Ф., Матвеева В.Н., Докторов А.А., Терехов С.М., Дружинина Р.А., Матвейчук И.В., Жилкин Б.А., Краснов А.П. Создание имплантационных материалов нового поколения на основе биостабильных композитов с костными клетками, полученными из стромальных клеток костного мозга // В кн.: Наука - городу Москве, Издание Московского комитета по науке и технике, 2005, т.2. С.36-40.
2. Kudelska-Mazur D Osteogenic cell contact with biomaterials influences phenotype expression. Cell Tissue Bank 2005, 6, 55-64.
3.Oshima H., Rochat A., Kedzia C., Kobayashi K., Barrandon Y. // Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells // Cell, 2001, v.104, P.233-245.
См. также:
Подходы к паспортизации и обеспечение безопасности при работе с клеточными материалами
Обонятельный эпителий и обонятельная луковица млекопитающих как источник аутологических глиальных, нейральных стволовых и прогениторных клеток
Опыт применения трансплантации стволовых кроветворных клеток при острых лейкозах в Онкогематологическом центре Свердловской областной клинической больницы №1
Инвестиционная привлекательность города Екатеринбурга для развития клеточных технологий и вариант оптимальной бизнес-модели
Эффективность комплексного применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток при лечении психических медикаментозно резистентных заболеваний
Эмбриональные стволовые и эмбриональные тератокарциномные клетки: регуляция плюрипотентного статуса и тератокарциногенеза
Опыт трансплантации негемопоэтических стволовых клеток у пациентов с хроническими формами ишемической болезни сердца
Изучение влияния генетических модификаций эмбриональных стволовых клеток мыши на их пролиферацию и дифференцировку in vitro
Нормативно-этические аспекты применения стволовых клеток
Создание тканеинженерного эквивалента костной ткани и перспективы его коммерциализации в россии
...
Обсудить на форуме
