Бочков Н. П.
(ГУ Медико-генетический научный центр РАМН; Россия, 115478, Москва, ул. Москворечье, 1; e-mail: bochnik@gmail.ru)
Количество стволовых клеток при взятии их из организма недостаточно для лечебных целей, поэтому введению их реципиенту предшествует культивирование с целью увеличения количества и освобождения аспиратов от нестволовых клеток. Культивирование сможет вести к возникновению клеток с аберрантным кариотипом и отбору клеток с наиболее высоким уровнем пролиферации, что может привести к «загрязнению» клеточного трансплантата трансформированными или даже озлокачествленными клетками.
Цитогенетическое исследование стволовых клеток, наряду с другими параметрами оценки качества, является одним из важных этапов контроля, позволяя определить генетическую стабильность клеточных линий и исключить клеточные линии, несущие хромосомные перестройки.
Цель работы - разработка алгоритма и проведение цитогенетического анализа стволовых клеток человека. Исследование было проведено на культурах мезенхимальных стромальных клеток (МСК), полученных из костного мозга и жировой ткани взрослых индивидов, и фетальных МСК на ранних пассажах.
Разработана методика цитогенетического исследования МСК человека. Определены условия культивирования клеток, отработана методика фиксации культур и приготовления цитогенетических препаратов. Цитогенетические параметры безопасности стволовых клеток изучались по трем позициям: кариотипирование, оценка уровня анеуплоидии и хромосомных аберраций.
Проведено сравнение частоты различных хромосомных нарушений в культурах МСК. При анализе дифференциально окрашенных (G-окраска) препаратов МСК первых пассажей нарушений хромосомного набора обнаружено не было. На 11-14 пассажах в отдельных культурах выявлены клоны с измененными кариотипами (моносомия по 6-й хромосоме, робертсоновская транслокация 21/22). В одной культуре из костного мозга выявлен мозаицизм: часть клеток имела нормальный мужской кариотип (46,XY), другая часть - 45,X.
Для анализа уровня анеуплоидии и полиплоидии в культурах фетальных МСК была применена методика флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с зондами на хромосомы 12, 17, 3,xи Y. Частота клеток с моносомией и трисомией по отдельным изученным хромосомам соответствует таковой для культур лимфоцитов. Однако обнаружена повышенная частота полиплоидных клеток в культурах. Она составила 0,8-3,0%.
Проведена оценка спонтанного уровня хромосомных аберраций в культурах МСК из жировой ткани. Он укладывается в верхние границы уровня спонтанных хромосомных аберраций для культур лимфоцитов человека. Основную долю аберраций составили одиночные фрагменты. Были также отмечены полиплоидные клетки.
Таким образом, уже на ранних стадиях культивирования обнаруживаются изменения кариотипа, что свидетельствует о необходимости дальнейшего изучения хромосомной изменчивости стволовых клеток человека, в том числе при длительном культивировании.
Экспериментальная работа с культурами МСК показала, что методические приемы (снятие клеток с флаконов, гипотонизация, фиксация) для приготовления цитогенетических препаратов должны быть щадящими. Разорванных клеток с разбросанными хромосомами встречается много больше, чем в препаратах из культур лимфоцитов. Может быть, по этой причине мало опубликованных работ по анализу хромосомных наборов в культурах региональных стволовых клеток. Между тем, как показано в настоящей работе, кариотипические изменения достаточно выражены после нескольких пассажей культур. Этот факт очень важен с точки зрения безопасности клеточной терапии, и поэтому необходимо подробное изучение закономерностей хромосомной изменчивости стволовых клеток, что в настоящее время и проводится в нашей лаборатории.
Хромосомная изменчивость МСК выражается в виде нестабильных хромосомных аберраций, транслокаций хромосом и анеуплоидий. Значимость таких изменений пока не ясна, но вряд ли они безразличны для судьбы клеток, которые после культивирования будут трансплантированы в организм. При этом надо иметь в виду, что примененные в данной работе методы позволяют учитывать только крупные хромосомные аномалии и анеуплоидии, а использование молекулярно-цитогенетических методов может выявить их еще в большем масштабе.
Из наших наблюдений следует, что имеет место селективное размножение клеток с аномальным криотипом. Следовательно, необходим цитогенетический контроль стволовых/прогениторных клеток перед их трансплантацией, как часть системы обеспечения безопасности клеточной терапии. Клеточная терапия тем безопаснее, чем меньше делений пройдет в культуре стволовых клеток.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 06-04-49135) и гранта НШ-1006.2006.7
См. также:
Клинико-экспериментальные клеточные технологии в лечении больных ишемической кардиомиопатией
Опыт Украины в области регулирования деятельности по стволовым клеткам
Эффективность и безопасность стимуляции выброса стволовых клеток при остром ишемическом инсульте
Клеточные технологии для восстановления структурной и функциональной активности поврежденных тканей
Развитие наукоемких технологий в Дальневосточном регионе - одно из направлений демографической политики Правительства РФ
Подходы к паспортизации и обеспечение безопасности при работе с клеточными материалами
Обонятельный эпителий и обонятельная луковица млекопитающих как источник аутологических глиальных, нейральных стволовых и прогениторных клеток
Опыт применения трансплантации стволовых кроветворных клеток при острых лейкозах в Онкогематологическом центре Свердловской областной клинической больницы №1
Инвестиционная привлекательность города Екатеринбурга для развития клеточных технологий и вариант оптимальной бизнес-модели
Эффективность комплексного применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток при лечении психических медикаментозно резистентных заболеваний
...
Обсудить на форуме
