Деев Р.В.1, Цупкина2 Н.В., Гребнев1 А.Р., Бозо1 И.Я., Рыков3 Ю.А., Исаев4 А.А., Тихилов3 Р.М., Пинаев2 Г. П.
(1 - Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург; e-mail: deev@celltranspl.ru, 2 - Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, 3 - ФГУ «Российский институт травматологии и ортопедии им. Р.Р. Вредена», Санкт-Петербург, 4 - ОАО «Институт стволовых клеток человека», Москва)
Исследование закономерных процессов посттравматической регенерации, выполненные в последней трети ХХ века, позволили выявить источники репаративной регенерации костной ткани, ее камбиальный резерв, расширив это собирательное понятие и включив в него помимо остеогенных клеток периоста и эндоста, клетки периваскулярного окружения микрососудов и стромальные клетки костного мозга (Гололобов В.Г., 1997; Owen M.E., Friedenstein A.J., 1987). Вместе с тем, при ряде повреждений костных органов возникает состояние так называемой остеогенной недостаточности, когда собственные клеточные источники не в состоянии восполнить утраченную костную ткань (Деев Р.В., 2004). В таких обстоятельствах представляется целесообразным использование современных клеточных технологий, предполагающих применение аутогенных костных клеток, накопленных в условиях культивирования in vitro и внесенных в костную рану или сформированный костный дефект в качестве биоартифициального пополнения камбиального резерва костной ткани.
Привнесение клеточных элементов в костное ложе неизбежно влияет на изменение динамики репаративного остеогистогенеза как за счет влияния на восстанавливающуюся ткань, так и за счет дополнительного гистогенеза пересаженными клетками при условии сохранения им жизнеспособности. Очевидно, чтобы максимально оптимизировать данный процесс сохранения способности к пролиферации и остеогенной дифференцировке недостаточно.
Использование принципов костной пластики подразумевает реализацию при пересадке клеточного и/или тканевого трансплантата ряда подходов - создания условий не только для интеграции тканей реципиентного ложа и трансплантата, но и остеокондукциии - способности направлять или проводить через себя рост регенерирующей костной ткани; остеоиндукции - способности индуцировать остеогенную дифференцировку камбиальных клеток; остеогенности - наделение трансплантата клетками с остеобластической детерминацией.
В большой степени вышеизложенным подходам отвечают методологические подходы тканевой инженерии костной ткани.
Создание тканеинженерного эквивалента костной ткани предполагает сочетание в одном изделии материала - носителя и совокупности остеогенных клеток. По нашим представлениям, достаточно эффективным носителем может служить человеческий деминерализованный костный матрикс (ДКМ), заселенный аутогенными стромальными клетками пациента. Для проверки данной гипотезы предпринято экспериментальное исследование.
Материал и методы. Эксперимент выполняется на взрослых кроликах обоего пола. В качестве источника стромальных клеток с остеогенными потенциями использовали костный мозг, локализованный в крыльях подвздошных костей.
После наращивания количества стромальных клеток in vitro, выполненное по известным протоколам (Owen, M.E., Friedenstein A.J., 1987), осуществляли заселение деминерализованного костного матрикса этими клетками из расчета 106 клеток на 1 см3 материала. Для усиления их остеогенной дифференцировки, формирующиеся графты культивировали в течение 7 суток в среде, содержащей L-аскорбат (0,2 мМ), ?-Nа-глицерофосфат (10 мМ) и дексаметазон в количестве 10-8 моль. С целью контроля совместимости ДКМ и клеток выполняли трансмиссионную и сканирующую электронную микроскопию, изучали полутонкие срезы, окрашенные толуидиновым синим.
В дальнейшем, кроликам, с соблюдением правил гуманного обращения с животными, выполняли протяженный (2 см) тотальный дефект большеберцовой кости. Отломки фиксировали при помощи спиц Киршнера. В сформированный дефект помещали графты. Рану послойно ушивали. В качестве контроля использовали животных, у которых дефект заживал без дополнительных лечебных манипуляций; животных, которым вносили только ДКМ. В ряде случаев, для регистрации жизнеспособных пересаженных клеток в составе регенерата, клетки окрашивали витальным красителем PKH-26 (Sigma, США), в этом случае, перед микроскопированием для визуализации ядер клеток всего регенерата, препараты дополнительно окрашивались DAPI (Sigma, США). Контроль результатов костной пластики различными материалами будет проведен на сроках от 15 до 150 суток при помощи световой микроскопии, гистоморфометрии, рентгенографии и компьютерной томографии, иммуноморфологических методов.
Результаты. В результате пилотных экспериментов установлено, что ДКМ, полученный из губчатой кости человека может выполнять роль носителя для клеток при изготовлении тканевого эквивалента костной ткани, поскольку по своей архитектонике в точности воспроизводит структуру губчатой кости (рис. А).
Его площадь позволяет разместить на поверхности большое количество культивированных клеток - до 106 на см3. Культивированные остеогенные клетки адгезируются к нему, распластываются и колонизируют свободные поверхности (рис. В).
При анализе полутонких срезов установлено, что не все клетки на поверхности матрикса имеют одинаковую морфологию. Часть клеток располагается кластерами, приобретает кубовидную форму и цитоморфологию характерную для остеобластов (рис. С, D).
В ряде случаев цитоплазма клеток образует тонкие выросты, выстилающие ДКМ. По данным трансмиссионной электронной микроскопии культивированные клетки не всегда плотно адгезированы к поверхности ДКМ, в основном связь с матриксом осуществляется за счет нескольких контактов, в то время как между коллагеновым деминерализованным матриксом и клеткой сохраняется свободное пространство (рис. Е).
Ультраструктура клеток при этом, соотношение гетеро- и эухроматина свидетельствуют об активных метаболических процесса (рис. F).
Исходя из полученных данных, мы считаем, что нами изготовлен костный графт, состоящий из человеческого деминерализованного костного матрикса, заселенного культивированными стромальными клетками.
При исследовании костного регенерата, полученного от животных на ранних сроках - 20 суток, установлено, что пересаженные клетки не только сохраняют свою жизнеспособность после пересадки на ДКТ, но и активно включаются в процессы посттравматического гистогенеза. Подобное влияние может реализовываться на уровне посттравматического остеогистогенеза двумя путями.
Во-первых, местной трофической и цитокиновой поддержкой репаративного остеогистогенеза, потенцируя индукционные влияния факторов, содержащихся в ДКТ. Во-вторых, путем непосредственного включения в остеогенез, дифференцировкой по остеобластическому пути и наработкой дополнительного объема воссоздаваемой костной ткани, являясь параллельным (альтернативным) посттравматическим остеогистогенезом.
По нашим данным, клетки сохраняли cвою жизнеспособность, однако локализовались, преимущественно в межтрабекулярных пространствах формирующейся костной ткани, зарегистрировать новообразованные остеобласты или остеоциты имевшие трансплантационное происхождение - пока не удалось (рис. G, H).
Проводимое экспериментальное исследование имеет целью выявить возможные пути использования клеточных биотехнологий в практической травматологии и ортопедии. Разумеется, создание «клеточного препарата» в виде тканеинженерного эквивалента костной ткани подразумевает определенную этапность исследований: доклинические экспериментальные исследования, ограниченные клинические исследования и широкое клиническое применение. Данная стратегия отработана на других видах медицинских технологий и принципиально схожа как в России, так и за рубежом. Вместе с тем, выполнение подобных исследований в России находится только в начальной фазе. Зачастую этап доклинической экспериментальной работе либо отсутствует, либо выполнен на примитивном теоретическом и технологическом базисе, что, безусловно, негативно сказывается на развитии клеточных технологий.
В современном мире патология органов опорно-двигательного аппарата, в том числе травматического генеза прочно удерживает 2-3 место в структуре заболеваемости. Создание тканеинженерного эквивалента костной ткани может стать альтернативой традиционным методам лечения такой сложной для лечения патологии, как дефекты костей. Пример западных стран показывает нам, что на рынке уже имеются медицинские услуги, основанные на этой патологии - препараты Osteocel® (Osiris Therapeutics, Inc., США), Bio-Seed®-Oral Bone (BioTissue Technologies GmbH, Германия-Швейцария-Италия), представляющие собой аллогенную костную матрицу, заселенную остеогенными клетками. Финансовые показатели фирм-производителей свидетельствуют об успешном продвижении данных продуктов на рынке (Деев Р.В., 2006).
Литература:
1. Гололобов В.Г. Регенерация костной ткани при заживлении огнестрельных переломов. - СПб. : Петербург ХХI, 1997. - 160 с.
2. Owen M.E., Friedenstein A.J. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. Cell and molecular biology of vertebrate hard tissues. Proceedings of a symposium held at the Ciba Foundation. London. Oct. 13-15, 1987. - London: John Wiley & Sons. 1988. - P. 42-53.
3. Деев Р.В. регенерационный остеогистогенез и возможности оптимизации репаративной регенерации костной ткани. В кн.: Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии: гистогенез и регенерация тканей. Труды Военно-медицинской академии. Т. 257/ под ред. Р.К. Данилова. - СПб.: ВМедА, 2004. - С. 110-120.
4. Деев Р.В. Анализ рынка клеточных препаратов для коррекции патологии скелетных тканей. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2006; 2(4). - С. 78-83.
Рис.
А - Внешний вид ДКМ. СЭМ, ?30.
В - Культура стромальных клеток костного мозга, заселившая ДКМ. СЭМ, ?600.
С - Стромальные клетки костного мозга с остеобластическим фенотипом на поверхности ДКМ. Окраска: толуидиновый синий, ?900.
D - Группа стромальных клеток костного мозга, выстилающих поверхности ДКМ. Окраска: толуидиновый синий, ?400.
Е - Фрагмент цитоплазмы стромальной клетки костного мозга на поверхности ДКМ. ТЭМ, ?5000.
F - Свободное пространство между клеткой и ДКМ после 7 суток культивирования. ТЭМ, ?5000.
G - PKH-26-положительные клетки, локализванные в межтрабекулярных пространствах воссоздаваемой кости, 20 суток после пересадки на носителе из ДКМ. ?400.
H - То же поле зрения, что и на G. Стрелками указаны ядра остеоцитов в новообразованной костной ткани. Окраска: DAPI. ?400.
См. также:
Подходы к паспортизации и обеспечение безопасности при работе с клеточными материалами
Обонятельный эпителий и обонятельная луковица млекопитающих как источник аутологических глиальных, нейральных стволовых и прогениторных клеток
Опыт применения трансплантации стволовых кроветворных клеток при острых лейкозах в Онкогематологическом центре Свердловской областной клинической больницы №1
Инвестиционная привлекательность города Екатеринбурга для развития клеточных технологий и вариант оптимальной бизнес-модели
Эффективность комплексного применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток при лечении психических медикаментозно резистентных заболеваний
Эмбриональные стволовые и эмбриональные тератокарциномные клетки: регуляция плюрипотентного статуса и тератокарциногенеза
Опыт трансплантации негемопоэтических стволовых клеток у пациентов с хроническими формами ишемической болезни сердца
Изучение влияния генетических модификаций эмбриональных стволовых клеток мыши на их пролиферацию и дифференцировку in vitro
Нормативно-этические аспекты применения стволовых клеток
Пролиферативные потенции мезенхимальных стволовых клеток костного мозга на поверхности титана и золота
...
Обсудить на форуме
