Шишацкая Е.И.
(Институт биофизики Сибирского отделения РАН. г. Красноярск; e.mail: shishatskaya@inbox.ru)
Успешное внедрение в практику экспериментальной биологии и медицины методов длительного культивирования клеток, в том числе клеток - предшественников специализированных тканей, создали предпосылки для разработки новых технологий и подходов для реконструктивной ортопедии. Учитывая высокий травматизм и большое количество ортопедических манипуляций, разработка новых эффективных методов реконструктивной ортопедии является одной из важнейших проблем травматологии и ортопедии. Со стволовыми клетками применительно к восстановлению костных дефектов в настоящее время связывают большие надежды. Используемый в тканевой инженерии междисциплинарный подход направлен в первую очередь на создание новых биокомпозиционных материалов для восстановления утраченных функций отдельных тканей или органов в целом. Основные принципы данного подхода заключаются в разработке и применении при имплантации в поврежденный орган или ткань носителей из биодеградирующихся материалов, которые используют в сочетании с донорскими клетками и/или с биоактивными веществами. Однако для успешной индукции остеосинтеза в месте имплантации необходимо создать высокую начальную концентрацию клеток (до 107-108 клеток), так как простое введение суспензии клеток в ряде случаев не является эффективным, поэтому возникает необходимость поиска адекватного носителя для закрепления трансплантируемых клеток в организме реципиента. При этом одной из сложных проблем является выбор адекватного носителя для клеток. Основную часть биоматериалов для восстановления костных дефектов до недавнего времени получали из хрящевой и/или костной тканей человека и животных, а также компонентов кожи, сухожилий, мозговой оболочки.
В настоящее время для реконструкции костных дефектов в ортопедии, травматологии и хирургической стоматологии наиболее распространенным материалам с четко выраженной опорной функцией является искусственные и натуральные кальций-фосфатные материалы. Одним из подходов, направленных на улучшение механических свойств биоматериалов из гидроксиапатита (уменьшение жесткости, повышение эластичности) стало недавно сформированное направление исследований, ориентированное на получение композитов гидроксиапатита с синтетическими полимерами. Новым решением проблемы является создание гибридных материалов на основе гидроксиапатита и полимеров, способных к биодеградации.
Среди разрушаемых полимеров особое место занимает новый класс природных полиметров, синтезируемых микроорганизмами. Это линейные полиэфиры - полигидроксиалканоаты (ПГА), которые представляют большой интерес для ортопедии в связи с их высокой биосовместимостью, медленной биодеградацией и механической прочностью. Однако исследования ПГА применительно к задачам реконструктивной ортопедии только разворачиваются.
Целью работы было создание гибридных композитов и биоконструкций на основе биоразрушаемых полигидроксиалканоатов (ПГА) и исследование их эффективности для выращивания остеогенных клеток и репаративного остеогенеза.
Механо-физическим методом получена серия образцов гибридного композита из биоразрушаемого полиэфира полигидроксибутирата (ПГБ) и гидроксиапатита (ГАП) с различным соотношением компонентов. С применением электронной микроскопии, рентгена, ДТА, диэлькометрии исследованы структура и физико-химические композита в зависимости от соотношения в нем компонентов. Наполнение полимера гидроксиапатитом существенно влияло на свойства поверхности композита. Показано, что с увеличением доли ГАП свободная энергия межфазовой поверхности, сила сцепления, следовательно, прочность адгезионного шва между поверхностью композита и водной фазой, а также смачиваемость поверхности возрастали. Наполнение полимера гидроксиапатитом не влияло на температуру плавления композита, но изменяло температуру деградации, - с ростом содержания ГАП от 10 до 50% (по массе) Тдегр. композита падала от 260 до 225°С. Степень кристалличности композитов с ростом доли ГАП возрастала, от 77% до 89% при содержании ГАП, соответственно, 10 и 50%.
Полученные гибридные композиты полигидроксибутирата с гидроксиапатитом (ПГБ/ГАП) исследованы в серии экспериментов, которые включали клеточные тесты in vitro и опыты на лабораторных животных. Для конструирования биоактивных имплантатов пористые матриксы ПГА/ГАП засевали остеобластическими клетками, полученными из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МСК) крыс линии Вистар. Интенсивность клеточной пролиферации определяли после 10 суток культивирования, используя ММТ-тест. Активность щелочной фосфатазы определяли в остеобластах после культивирования в течение 10 суток в реакции с паро-нитрофенолфосфатом (использовали «Diagnostic kit 245», Sigma).
Количество пролиферирующих остеобластических клеток было больше на всех образцах композита ПГБ/ГАП по сравнению с полимерным матриксом из ПГБ, не содержащем гидроксиапатита (рис.1а).
Рис. 1. Пролиферация остеобластов крысы в тесте ММТ (а) и активность щелочной фосфатазы (ЩФ) (б) in vitro на 10-й день культивирования на гибридных композитах ПГБ/ГАП с содержанием гидроксиапатита 10, 20, 30, 40 и 50 вес.% (2, 3, 4 и 5, соответственно) по сравнению с ПГБ (1).
Наибольший прирост клеток зафиксирован на образцах композита с содержанием гидроксиапатита 10 и 20%, соответственно, 240-260·106. При более высоком содержании ГАП в композите плотность клеток была ниже, однако достовернее выше, чем на полимерном матриксе. Более гидрофильная поверхность гибридных матриксов способствовала активной прикрепляемости клеток, в результате этого исходная концентрация прикрепленных клеток на ПГБ/ГАП была выше, чем на полимерном матриксе. Активность щелочной фосфатазы, которая является маркером дифференцировки остеобластов, была достоверно выше на всех типах матриксов, содержащих гидроксиапатит, по сравнению с клетками, растущими на матриксе из ПГБ. Наибольшей активностью обладали клетки, растущие на матриксах с невысоким содержанием ГАП (10 и 20%), соответственно, 4,2 и 4,6 мМ/мин·клетка. Пористые конструкции из гибридного материала способствовали более выраженной адгезии клеток и росту клеток, поэтому были взяты для последующих исследований in vivo.
Остеогенный потенциал композитов ПГБ/ГАП, засеянных клетками, определяли в тесте эктопического костеобразования при подкожной подсадке лабораторным животным. Предварительно на поверхность стерильных образцы матриксов наносили столбик костного мозга крыс (15-20·106 клеток) в полной культуральной среде (90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, гентамицин 80 мг/л, L-глутамин 280 мг/л).
Биоактивные конструкции под ингаляционным наркозом имплантировали 2-месячным крысам линии Вистар. Через 45 суток животных выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира, извлекали и изучали имплантаты. Результаты эксперимента (физиологическое состояние животных, картина крови, состояние тканей в месте имплантации конструкций) позволили заключить, что испытанные имплантаты биоинертны и не вызывают значительных реактивных изменений со стороны иммунной системы животных и системы крови, а также выраженных воспалительных и других негативных реакций окружающих тканей. Клетки костного мозга пролиферировали на поверхности и в объеме матриксов. Через 45 суток снаружи имплантаты были покрыты тонкой капсулой; на их поверхности отмечена новообразованная соединительная ткань с большим количеством клеточных элементов (рис. 2).
Рис. 2. Гистологическая картина поверхности гибридного имплантата ПГБ/ГАП с клетками костного мозга через 45 суток после подкожной имплантации крысам Вистар (окраска гематоксилин-эозин): образование костной ткани (показано стрелками) в порах имплантата, увеличение х100.
Новообразованная ткань была представлена клетками фибробластического ряда, мононуклеарами (макрофагами и лимфоцитами), многоядерными клетками, пронизана кровеносными капиллярами, располагающимися между коллагеновыми волокнами. В многочисленных участках, прилежащих к имплантату, наблюдали формирование костной ткани. Выявлены разнообразной величины и формы участки остеоидной ткани, образующие как отдельные островки, так и ячейки, в которых расположены паренхиматозные (костного мозга) и стромальные клетки, эритроциты. Основное вещество остеоидной ткани окрашивалось гомогенно, главным образом базофильно (это говорит о незрелости ткани) с примесью оксифилии. Наблюдали «слоистость» основного вещества ткани, определяемая ходом коллагеновых волокон и расположенных вдоль них клеток. Костные клетки расположены более или менее регулярно, имели вытянутую или округлую форму с овальными либо уплощенными ядрами.
Результаты эксперимента показали, что сконструированные гибридные имплантаты из гидроксиапатита и полигидроксибутирата способствуют образованию костной ткани из МСК in vitro и могут быть использованы для дальнейших исследований в качестве биоактивных конструкций для регенерации дефектов костей.
Работа выполнена при финансовой поддержке молодежного гранта № МК-4149.2006.4 Программы Президента РФ и Программе интеграционных исследований СО РАН (проект № 14).
См. также:
Индукция апоптоза и пролиферации - иммунофизиологический механизм действия аллогенных прогенеторных клеток
Клеточные технологии для нейрорегенерации
Разработка биоинженерных конструкций на основе аутологичных мезенхимальных стволовых клеток и наноструктурированных материалов-матриксов синтетических и природного происхождения с целью восстановления костных дефектов у экспериментальных животных
Характер метилирования ДНК метафазных хромосом мезенхимных стволовых клеток человека
Аутологичная трансплантация кроветворных стволовых клеток при рассеянном склерозе: результаты исследования Российской кооперативной группы клеточной терапии
Разработка полимерных матриц для культивирования клеток кожи
Клиническая оценка отдаленных результатов трансплантации аутологичных стволовых клеток костного мозга у кардиохирургических больных с сердечной недостаточностью
Мононуклеарные клетки костного мозга, активированные последовательно in vivo и ex vivo, улучшают ремоделирование и функцию миокарда при хронической ишемической сердечной недостаточности
Лечение ложных суставов длинных трубчатых костей с применением аутологичных мезенхимных стволовых клеток
Трансплантация иммобилизированных аутологичных мезенхимных стволовых клеток при замещении ограниченных дефектов костной ткани
...
Обсудить на форуме
