Хлусов И.А., С.А. Наумов1, Е.А.Нечаева2, Т.Д. Колокольцова2, М.Ю. Хлусова, С.Б. Никифоров3, С.А. Антипов, А.М. Некрасова, Д.Л. Чухнова4
(Сибирский государственный медицинский университет Росздрава, г. Томск; e-mail: khl@ultranet.tomsk.ru; 1 - ООО “Новые медицинские технологии“, г. Томск; 2 - Институт клеточных культур ФГУП ГНЦ ВБ “Вектор”, г. Новосибирск; 3 - ООО “Научно-клинический центр онкологии и неврологии “Биотерапия“, г. Новосибирск; 4 - ООО “СибМедАналит”, г. Томск)
По данным ВОЗ, смертность от хронической печеночной недостаточности занимает 5-е место среди других заболеваний. На современном этапе исследований этой проблемы разработаны различные методы лечения как традиционного, так и альтернативного характера. По мнению ряда исследователей, наиболее перспективной является клеточная терапия. Трансплантация клеток развивается по четырем основным направлениям [3]: 1) пересадка дифференцированных, специализированных соматических клеток (например, островков поджелудочной железы при коррекции сахарного диабета); 2) применение стволовых клеток; 3) трансплантация эмбриональных (фетальных) клеток и тканей; 4) использование бессмертных линий трансфицированных клеток.
Тем не менее, конкретные механизмы лечебного действия и схемы использования клеточных препаратов мало изучены, особенно при хронической патологии.
В последнее время появились сообщения о генетических и эпигенетических изменениях во взрослых и эмбриональных стволовых клетках при длительном культивировании [4]. Рекомендуется для проведения доклинических и клинических испытаний применять клетки, прошедшие минимальное число пассажей в культуре [2]. С другой стороны, в связи с нехваткой донорского материала, методы ксенотрансплантации допускаются к клиническим испытаниям [5].
В связи с этим доклиническая аттестация гепатоцитов и уточнение механизмов, лежащих в основе коррекции заболеваний при помощи трансплантации первичной культуры ксеногенных эмбриональных клеток, представляет фундаментальный и практический интерес.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводились в осенне-зимний период на 73 белых крысах линии Wistar обоего пола массой 180 - 250 г, содержавшиеся в стандартных условиях вивария. Токсический гепатит у крыс вызывали путем подкожного введения CCl4 (четыреххлористый углерод) из расчета 0,4 мл/100г массы тела животного в виде 50% масляного раствора, дважды в неделю в течение четырех недель. В процессе моделирования экспериментального гепатита смертность животных составила 6%. На 30 сутки, перед проведением терапии, оценивали биохимические индексы крови и гистологические срезы печени на предмет признаков гепатита.
Первичную культуру клеток эмбриональной печени человека 14-18 недели гестации для инъекции получали в Институте клеточных культур ФГУП ГНЦ ВБ “Вектор” (г. Новосибирск). Клетки были выделены при искусственном прерывании беременности по медицинским показаниям без наличия маркеров инфекции со стороны матери и плода согласно данным ПЦР и ИФА. Клеточный состав препаратов эмбриональной печени человека после разморозки оказался следующим: 49-54% гепатоциты, 30-35% эритроидные нормобласты, 4-8% лимфоциты, 3-5% фибробластоидные клетки, 3% макрофаги, единичные гранулоциты. Применявшиеся клетки неплохо сохранялись после размораживания, жизнеспособность составляла 51±12% (42-85%). Однако, следует заметить, что выживали небольшие по размеру клетки. Крупные (порядка 20 мкм) гепатоциты, как правило, погибали. Попытки отделить гепатоциты от других клеток резко снижали жизнеспособность культуры.
Трансплантацию культуры клеток проводили путем однократного подкожного введения 107 клеток/кг в 0,5 мл сбалансированного фосфатного буфера в область проекции печени. Одномоментно, при помощи аппарата для гальванизации “Поток-1”, начинали курсовое воздействие постоянным электрическим током в проекции печени. Сила тока во всех отведениях варьировала в диапазоне 3 - 5 мА, плотность тока 0,9-1,5 мА/см2. Длительность воздействия составляла 5 минут, курс лечения - 5 дней.
Вывод животных из эксперимента осуществлялся под эфирным наркозом путем одномоментной декапитации на 7, 14 и 28-й дни после трансплантации клеток.
В сыворотке крови, в гомогенате печени определяли биохимические показатели: концентрацию малонового диальдегида (МДА) и прямого билирубина, активность каталазы и аминотрансфераз (аспартатаминотрансфераза, АсАТ; аланинаминотрансфераза, АлАТ), значения тимоловой пробы.
Части печени фиксировали в нейтральном 10% формалине в течение 24 ч, готовили тонкие парафиновые срезы, окрашивали по стандартной методике гематоксилином и эозином. Под микроскопом определяли количество двуядерных и некротических форм гепатоцитов (кариопикноз, фрагментация ядра, кариорексис, вакуолизация ядра и цитоплазмы, кариолиз, цитолиз) на 100 встреченных печеночных клеток.
Полученные результаты обрабатывали статистически согласно t-критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Однократное подкожное введение крысам Wistar культуры эмбриональных гепатоцитов слабо влияло на динамику (7, 14 и 28-е сутки после введения клеток) окислительно-восстановительных процессов в гомогенате печени крыс с хроническим токсическим гепатитом. В то же время, анализ гистологических срезов показал определенный гепатопротекторный эффект инъекции препарата эмбриональных клеток. Так, в динамике посттоксического восстановления печеночной паренхимы в 2-3 раза уменьшалось число некротических форм гепатоцитов (табл.1), в некоторой степени стимулировалась регенерация органа. Как следствие, сывороточные индексы гепатита (АлАт, АсАт, тимоловая проба) к концу периода наблюдений (28-е сутки после трансплантации клеток) снижались до уровня интактных животных.
Таблица 1. Количество (%) некротических форм гепатоцитов в динамике коррекции токсического гепатита, Х±m.
Интегральный показатель эффективности клеточного трансплантата на протяжении всего периода наблюдений (7-28-е сутки после введения клеток) позволил предположить, что ксеногенные клетки печени реализуют гепатопротекторный эффект, не связанный с торможением ПОЛ внутри печени. В свою очередь, курс электрофореза, после кратковременного усиления ПОЛ, в отдаленные сроки также улучшал некоторые показатели гомеостаза (табл.2) и морфологическое состояние печени (табл.1), по-видимому, за счет известного противовоспалительного эффекта физиотерапевтических манипуляций. Тем не менее, эффект клеточной терапии оказался более стабильным.
Комбинация двух способов коррекции токсического гепатита не привела к ожидаемому синергичному эффекту ни по морфологическим (табл.1), ни по биохимическим индексам. Показатели статистически не отличались от клеточной монотерапии. С другой стороны, если рассматривать электрофорез как дополнительный раздражитель (табл.2), способствующий реализации резистентной стратегии адаптации [1], можно заключить, что клетки функционируют при смешанных физико-химических повреждениях.
Таблица 2. Динамика биохимических показателей сыворотки крови и гомогената печени после 5-дневного курса электрофореза у крыс с хроническим токсическим гепатитом, Х±m.
Примечание: здесь и в табл.1 (*) - статистически значимые различия (p<0,05) по сравнению с исходным уровнем; (#) - по сравнению с гепатитом (контроль).
По-видимому, эмбриональные печеночные клетки определенное время работают в режиме заместительной терапии, активно связывая эндогенные и экзогенные токсины, вырабатывая альбумин и другие белки (трансферрин, глобулины и т.д.), что способствует постнекротической репарации печени согласно толерантной стратегии адаптации [1] к экстремальным раздражителям.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кулинский В.И., Ольховский И.А. // Успехи современной биологии.-1992.- Т.112.-Вып.5-6.-С.697-713.
2. Мелихова В.С. // Клеточная трансплантация и тканевая инженерия.-2005.-№ 2.-С.16-17.
3. Сухих Г. Т. // Бюлл. эксперим. биол. и мед.-1998.-Т.126.-Прил.1.-С.3-13.
4. Draper J.S., Smith K., Gokhale P. et al. // Nat. Biotechnol.-2004.-Vol.22.-P.53-54.
5. Savitz S.I., Rosenbaum D.M., Dinsmore J.H., Wechsler L.R., Caplan L.R. // Ann. Neurol.-2002.-Vol.52.-P.266-275.
См. также:
Модель организации клинического центра клеточных технологий на примере реального коммерческого проекта в городе екатеринбурге с учетом swot-анализа положения дел в области исследований стволовых клеток в россии
Сравнительный анализ интрамиокардиальной аутологичной трансплантации постнатальных стволовых клеток из периферической крови и жировой ткани у больных в остром периоде инфаркта миокарда
Физико-химическая регуляция in vitro пула стволовых кроветворных и стромальных клеток костного мозга
Эффект наноразмерных частиц и магнитного поля на колониеобразующую активность унипотентных кроветворных прекурсоров in vitro
Индукция апоптоза и пролиферации - иммунофизиологический механизм действия аллогенных прогенеторных клеток
Клеточные технологии для нейрорегенерации
Разработка биоинженерных конструкций на основе аутологичных мезенхимальных стволовых клеток и наноструктурированных материалов-матриксов синтетических и природного происхождения с целью восстановления костных дефектов у экспериментальных животных
Характер метилирования ДНК метафазных хромосом мезенхимных стволовых клеток человека
Аутологичная трансплантация кроветворных стволовых клеток при рассеянном склерозе: результаты исследования Российской кооперативной группы клеточной терапии
Резорбируемые матриксы из полиэфиров и гидроксиапатита для выращивания мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и реконструктивного остеогенеза
...
Обсудить на форуме
