Хлусов И.А., С.А. Наумов1, М.Ю. Хлусова2
(ООО “СибМедАналит”, 1 - ООО “Новые медицинские технологии“, 2 - Сибирский государственный медицинский университет, Томск; e-mail: khl@comm.tomsknet.ru)
В последние годы накоплены данные по регуляции жизненного цикла отдельных линий клеток. Существующий арсенал фармакологических средств предполагает использование их стимулирующего либо ингибирующего эффекта на размножение тех или иных клеток. В то же время, реакции стволовых элементов на неорганические факторы микроокружения в условиях многоклеточных систем изучены в меньшей степени и весьма противоречивы. Физико-химические факторы, в частности, радиационное и термическое воздействие, ультрафиолетовое излучение, цитостатические препараты, обладают, в основном, негативным эффектом на интенсивность клеточного роста. С другой стороны, возможно позитивное влияние некоторых режимов монохроматического света (лазерного или светодиодного) и переменного электромагнитного поля на жизнедеятельность клеток. Однако, дозы воздействия являются, как правило, экстремальными.
Целью исследования явилось изучение модулирующего влияния электрических импульсов, видимого света и некоторых микроэлементов в параметрах, приближенных к физиологическим, на жизнедеятельность родоначальных клеток костного мозга.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты по культивированию клеток in vitro проведены с использованием материала 14 здоровых мышей-самцов линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Животных умерщвляли эфирным наркозом.
В стерильных условиях во взвесь миелокариоцитов при 37o C помещали автономный электростимулятор желудочно-кишечного тракта (АЭС ЖКТ) с напылением ионов хрома или без такового. Электростимулятор генерирует импульсный ток с длительностью импульсов 5-7 мс, амплитудой импульсов 9-15 мА, длительностью пакета 16 импульсов 320-450 мс. Суммарная плотность энергии электрических импульсов варьировала в диапазоне W =0,1-3,6 Дж/см3.
В другом эксперименте миелокариоциты культивировали при температуре 37о С в течение 3 часов (инкорпоральное облучение) с фотонной таблеткой. В одном из экспериментов аналогичное световое воздействие на клетки проводили фотонной таблеткой, находящейся вне клеточного резервуара (экстракорпоральное облучение). Автономный фотостимулятор (АФС, фотонная таблетка) представляет собой миниприбор с напряжением питания 4,5 В, амплитудой импульсов тока 4 мА, длительностью импульса 6 мс, 16 импульсов в пачке, период следования пачек импульсов 3 с, длина волны 655 + 20 нм (красный диапазон).
Оценивали жизнеспособность костномозговых нуклеаров, собирали супернатанты миелокариоцитов, определяли колониестимулирующую и колониеингибирующую активности методом колониеобразования. Клонирование гранулоцитарных (КОЕ-Г) и фибробластоидных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф) осуществляли в течение 6 суток в полувязкой питательной среде в присутствие рекомбинантного Г-КСФ человека (ICN) в концентрации 1 нг/мл.
Статистическую обработку результатов осуществляли согласно t-критерию Стьюдента, Т-критерию Вилкоксона (PT) и U-критерию Манна-Уитни (Pu).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
При взаимодействии электромагнитных импульсов с биологическими объектами наиболее важными параметрами являются плотность мощности (интенсивность) I (Вт/см2), плотность энергии W (Дж/см2), длина волны, режим и длительность воздействия [1]. Проведенные исследования показали, что электрические импульсы способны оказывать как позитивное, так и негативное влияние на рост клеток in vitro. При этом направленность действия зависит от времени воздействия на взвесь клеток костного мозга, определяющего суммарную плотность энергии (табл. 1).
Таблица 1. Влияние суммарной плотности энергии (Дж/см3) электрических импульсов на количество КОЕ-Г и КОЕ-Ф в культуре (% от контроля, точка 0),x.
Примечание: (*) - отмечены достоверные (p<0,05) различия с контролем согласно U-критерию Вилкоксона-Манна-Уитни; n - число просчитанных лунок.
В условиях многоклеточных систем, помимо прямого влияния, возможен опосредованный эффект электрических импульсов на клеточный цикл родоначальных клеток, связанный с регуляцией синтетической функции миелокариоцитов. Удалось установить, что супернатанты костномозговых клеток, обработанных в жидкой среде в интервале W=0,2-0,4 Дж/см3, активировали гранулоцитарное колониеобразование в метилцеллюлозной культуре.
Дальнейшее увеличение W приводило к появлению растворимых факторов, подавляющих рост КОЕ-Г в присутствии рекомбинантного Г-КСФ. В отношении роста КОЕ-Ф супернатанты проявляли только супрессирующую компоненту при W > 0,4 Дж/см3 на фоне прямой электростимуляции пролиферации клеток-предшественников фибробластов. Следует отметить, что в безклеточной среде при W=2,4 Дж/см3 продукты электролиза не влияли на концентрацию КОЕ-Г и КОЕ-Ф. Выход прекурсоров в культуре не отличался от исходного (точка 0) и статистически значимо превышал соответствующие значения, полученные при добавлении клеточных супернатантов (на 160% и 67%, P<0,05).
В процессе электролиза из стальной оболочки электродов выделяются микроэлементы, в частности, хром, которые могут оказывать известное воздействие на клетки. Для проверки эффекта ионной составляющей электрического воздействия были использованы АЭС ЖКТ с напылением хрома в дозе, составляющей суточную потребность человека. Комбинированное воздействие на миелокариоциты электрического поля (W=3,6 Дж/см3) и катионов хрома полностью подавляло рост КОЕ-Г и КОЕ-Ф.
Экстремальным для КОЕ-Г и КОЕ-Ф фактором оказался также низкоэнергетический, импульсный монохроматический свет видимого спектра.
Экспозиция красного света с взвесью миелокариоцитов подавляла рост 80-90% родоначальных клеток (табл.2) в благоприятной питательной среде даже в присутствии Г-КСФ, являющегося мощным ингибитором апоптоза. За время инкорпорального воздействия красного импульсного света на жидкую культуру плотность энергии составила около 1 Дж/см3, поглощенная каждым миелокариоцитом доза варьировала в пределах 0,5 мГр. Естественно, что при удалении источника света от клеточной взвеси (экстракорпоральное облучение) его подавляющее действие на рост и размножение родоначальных клеток нивелируется (табл.2) вследствие снижения мощности фотонного воздействия, связанного, в частности, с усилением рассеивания и отражения света.
Таблица 2. Концентрация родоначальных клеток (на 105 нуклеаров) в 6-дневной культуре после обработки взвеси миелокариоцитов красным светом, X.
Примечание: (*) - достоверные различия с контролем;(#) - достоверные различия с инкорпоральным облучением согласноU-критерию Вилкоксона-Манна-Уитни. n - число просчитанных лунок.
Фоторецепция красного света внутриклеточными молекулами кислорода лежит в основе гиперпродукции активных форм кислорода и перекисей, являющихся медиаторами клеточной смерти. В этом плане интересны полученные нами данные, согласно которым воздействие in vitro красного импульсного света с плотностью энергии порядка 1 Дж/см3 сопровождалось статистически значимым (PT) увеличением морфологических индексов апоптоза и некроза во всех ростках костного мозга, прежде всего лимфоидном, в основном, за счет повышения выхода апоптотических тел.
Итак, клеточные эффекты физико-химических воздействий малоспецифичны. Тем не менее, в зависимости от плотности энергии и концентрации раздражителя можно осуществлять как позитивное, так и негативное регуляторное влияние на жизнедеятельность кроветворных и стромальных прекурсоров. Это может иметь практическое значение, наряду с фармакологическими и биологическими препаратами, для предварительной подготовки стволовых клеток к трансплантации, поскольку они в достаточной степени биологически инертны и нуждаются, например, в индукции пролиферации и/или дифференцировки перед использованием.
При этом влияние на жизнедеятельность кроветворных прекурсоров может протекать посредством не только прямых (физико-химических, биохимических и биофизических), но и опосредованных через клеточное микроокружение реакций, регулирующих направленность и интенсивность метаболических внутриклеточных процессов. По крайней мере, лимфоциты можно рассматривать в качестве кандидата на клетку-мишень микроокружения, способную, в зависимости от силы раздражителя, переключать программу роста кроветворных и стромальных клеток-предшественников костного мозга в многоклеточных системах.
Работа выполнена при поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по проекту № 5228 “Разработка и внедрение в практику современных методов контроля лечения и коррекции микроэлементных состояний организма человека”.
ЛИТЕРАТУРА
1. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях.-Саратов, 1998.
См. также:
Модель организации клинического центра клеточных технологий на примере реального коммерческого проекта в городе екатеринбурге с учетом swot-анализа положения дел в области исследований стволовых клеток в россии
Сравнительный анализ интрамиокардиальной аутологичной трансплантации постнатальных стволовых клеток из периферической крови и жировой ткани у больных в остром периоде инфаркта миокарда
Тестирование культуры клеток печени эмбриона человека при физиотерапии экспериментального токсического гепатита
Эффект наноразмерных частиц и магнитного поля на колониеобразующую активность унипотентных кроветворных прекурсоров in vitro
Индукция апоптоза и пролиферации - иммунофизиологический механизм действия аллогенных прогенеторных клеток
Клеточные технологии для нейрорегенерации
Разработка биоинженерных конструкций на основе аутологичных мезенхимальных стволовых клеток и наноструктурированных материалов-матриксов синтетических и природного происхождения с целью восстановления костных дефектов у экспериментальных животных
Характер метилирования ДНК метафазных хромосом мезенхимных стволовых клеток человека
Аутологичная трансплантация кроветворных стволовых клеток при рассеянном склерозе: результаты исследования Российской кооперативной группы клеточной терапии
Резорбируемые матриксы из полиэфиров и гидроксиапатита для выращивания мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и реконструктивного остеогенеза
...
Обсудить на форуме
