Хлусов И.А., В.И. Итин1, В.С. Седой2, Т.А.Федущак3, О.Г. Терехова1, А.А. Магаева1, Е.П. Найден4, С.А. Антипов5, А.М.Некрасова5
(ООО “СибМедАналит“, г. Томск; 1 - Отдел структурной макрокинетики ТНЦ СО РАН, г. Томск; 2 - Институт сильноточной электроники ТНЦ СО РАН, г. Томск; 3 - Институт химии нефти ТНЦ СО РАН, г. Томск; 4 - Томский государственный университет, г. Томск; 5 - Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск; e-mail: khl@ultranet.tomsk.ru)
Биологическое значение наноразмерных частиц рассматривается в следующих основных направлениях: 1) токсичность частиц износа имплантатов; 2) биосовместимость и специфическая активность собственно наночастиц; 3) свойства наночастиц как носителей (средств доставки) лекарственных препаратов и биологических молекул.
Активный поиск биосовместимых наноматериалов для конструирования систем целевой доставки лекарств и биологических молекул сосредоточен на липосомах и твердотельных частицах [1,2]. При этом предлагаются методы управления движением и свойствами наночастиц посредством прикладываемых магнитных полей. Накапливается все больше как позитивных, так и негативных сведений о молекулярных и клеточных эффектах наноразмерных частиц.
Функциональные методы определения активности клеток обладают высокой чувствительностью к природе тестируемого материала [3]. Данная работа посвящена изучению эффектов наночастиц оксидов металлов на колониеобразующую способность костномозговых прекурсоров гранулоцитопоэза в постоянном магнитном поле.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Порошки наноразмерных частиц металлов получали методами электрического взрыва проводников или механохимического синтеза. Электронная микроскопия показала, что наряду с частицами диаметром 10-40 нанометров, в порошках присутствуют их агрегаты размером до 100 нм. Фазовый состав синтезированных нанопорошков, представленных в табл.1-2, подтверждены данными рентгенофазового анализа (РФА).
Эксперименты in vitro проводились в осенне-зимний период с использованием клеточного материала костного мозга, взятого от 5 мышей линии СВА/CaLac и крыс линии Wistar. Животных умерщвляли эфирным наркозом, выделяли костный мозг бедренных костей в концентрации 0,5х106 кариоцитов/мл и культивировали в объеме клеточной взвеси 4,5 мл в течение 1 ч с порошками (3 нг/мл культуры клеток) наноферримагнитных оксидов железа Fe2O3, Fe3O4, CoFe2O4.
В контрольные пробирки добавляли соответствующий объем (0,5 мл) растворителя (изотонического раствора хлорида натрия).
Для изучения санитарно-химических свойств наночастиц в пределах 1-10 предельно допустимых концентраций (ПДК), нанопорошки растворяли в течение 7 дней при 37оС в изотоническом растворе хлорида натрия согласно требованиям ISO 10993-5 (1992 г.), оценивали изменения рН растворов.
Часть нефракционированной клеточной взвеси использовали для выявления колониеобразующей способности костного мозга. Цитотоксичность исследуемых образцов наночастиц определяли в тесте с 0,4% трипановым синим до и через 24 часа после культивирования с миелокариоцитами в описанных выше условиях.
Длительное (в течение 7 дней) клонирование клеток костного мозга проводили в 35-мм пластиковых чашках Петри при 37оС и 5% СО2 в концентрации 0,75х106 жизнеспособных кариоцитов в 1,5 мл культуральной среды. Для культивирования клеток применяли питательную среду (280 мг/л L-глутамина (Sigma), 40 мг/л гентамицина сульфат, 15% эмбриональной телячьей сыворотки (ICN), 85% среды 199 (НПО Вектор), позволяющую определять спонтанную (без факторов роста) колониеобразующую активность костного мозга. Контролем роста служила культура интактных миелокариоцитов после добавления изотонического раствора хлорида натрия. Половину исследуемых культур клонировали на магнитном коврике с напряженностью поля 200 Эрстед.
Через 7 дней подсчитывали число колониеобразующих единиц (КОЕ) - клонов родоначальной клетки. Под гранулоцитарными прекурсорами (КОЕ-Г) подразумевали колонии из 50 и более ядросодержащих элементов, имеющих морфологию гранулоцитов при окраске азуром II-эозином.
Статистическую обработку результатов проводили согласно непараметрическому U-критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (РU).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Водные 7-дневные экстракты наночастиц вызывали незначительное закисление растворителя: в ПДК - в пределах 0,03-0,12 ед.рН, в 10 ПДК - в пределах 0,17-0,22 единиц рН. По-видимому, наночастицы способны слабо взаимодействовать с гидроксильными группами, способствуя накоплению в растворе протонов водорода. Тем не менее, влияние наночастиц на модельную биологическую жидкость укладывается в пределы, рекомендуемые Госстандартом (+1,0 ед. рН).
Биологические эксперименты показали неоднозначные результаты (табл.1,2). Исследуемые наночастицы не обладали цитотоксичностью в 24-ч тесте с трипановым синим. Кроме того, кобальтовый феррит статистически значимо не влиял на выход КОЕ-Г в многоклеточной культуре костного мозга независимо от вида животных и прикладываемых воздействий.
Таблица 1. Содержание КОЕ-Г (на 105/мл) в культуре миелокариоцитов мыши после 7 суток культивирования, Х.
Примечание: здесь и в табл.2 (Р1) - статистически значимые различия с контролем, (P2) - с соответствующими значениями без магнитного воздействия.
В то же время наночастицы оксидов железа либо не влияли (у мышей), либо стимулировали функциональную активность гранулоцитарных прекурсоров. При этом постоянное магнитное поле оказывало модулирующее (реверсивное) действие на рост клеток, прокультивированных с наночастицами (табл.1,2).
Таблица 2. Содержание КОЕ-Г (на 105 /мл) в культуре миелокариоцитов крыс после 7 суток культивирования,x.
Таким образом, функциональные свойства наночастиц в многоклеточных системах, а также в условиях дополнительных манипуляций, требуют дальнейшего изучения. Они могут зависеть не только от прямого влияния на пул стволовых клеток, но опосредоваться через факторы микроокружения, состояние которых у различных индивидуумов и в различных условиях жизнедеятельности весьма изменчиво.
ЛИТЕРАТУРА
1. Биологические методы лечения онкологических заболеваний: Пер. с англ./ Под ред. В.Т.ДеВита, С.Хеллмана, С.А. Розенберга.-М., 2002.
2. Каплун А.П., Ле Банг Шон, Краснопольский Ю.М., Швец В.И. // Вопросы медицинской химии.-1999.-№ 1.-С.3-12.
3. Johnson H.J., Northup S.J., Seagraves P.A. e.a. // J. Biomed. Mater. Res.-1985.-Vol.19.-P.489-508.
См. также:
Модель организации клинического центра клеточных технологий на примере реального коммерческого проекта в городе екатеринбурге с учетом swot-анализа положения дел в области исследований стволовых клеток в россии
Сравнительный анализ интрамиокардиальной аутологичной трансплантации постнатальных стволовых клеток из периферической крови и жировой ткани у больных в остром периоде инфаркта миокарда
Тестирование культуры клеток печени эмбриона человека при физиотерапии экспериментального токсического гепатита
Физико-химическая регуляция in vitro пула стволовых кроветворных и стромальных клеток костного мозга
Индукция апоптоза и пролиферации - иммунофизиологический механизм действия аллогенных прогенеторных клеток
Клеточные технологии для нейрорегенерации
Разработка биоинженерных конструкций на основе аутологичных мезенхимальных стволовых клеток и наноструктурированных материалов-матриксов синтетических и природного происхождения с целью восстановления костных дефектов у экспериментальных животных
Характер метилирования ДНК метафазных хромосом мезенхимных стволовых клеток человека
Аутологичная трансплантация кроветворных стволовых клеток при рассеянном склерозе: результаты исследования Российской кооперативной группы клеточной терапии
Резорбируемые матриксы из полиэфиров и гидроксиапатита для выращивания мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и реконструктивного остеогенеза
...
Обсудить на форуме
