Чиссов В.И.1, Сергеева Н.С.1, Свиридова И.К1., Решетов И.В1., Баринов С.М2, Франк Г. А1., Тепляков В.В.1, Кирсанова В.А1., Ахмедова С.А1., Агзамов Д.С.1, Филюшин М.М1., Елинсон В.М.3, Комлев В.С2., Фадеева И.В2, Козлов В.В1., Бухаров А.В., Хесуани Ю4.
(1 - ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П. А. Герцена Росздрава»; 2 - Институт физико-химических проблем керамических материалов РАН, ИПК РАН; 3 - МАТИ-РГТУ им. К. Э. Циолковского; 4 - Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М. В. Ломоносова; e-mail: mnioi@mail.ru)
Результаты фундаментальных исследований последнего десятилетия открыли перспективы принципиально нового направления - регенеративной медицины, основанной на клеточной терапии с использованием мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Высокий пролиферативный потенциал МСК, способность сохранять фенотип на протяжении ряда пассажей и уникальная пластичность делают МСК блестящими кандидатами для заместительной клеточной терапии.
В настоящее время в России и за рубежом клеточная терапия на основе МСК апробируется при различных патологических состояниях: сердечно-сосудистых заболеваниях, в травматологии и ортопедии, неврологии, челюстно-лицевой хирургии, онкологии, косметологии. В онкологической клинике использование МСК актуально и перспективно при реконструктивно-пластических операциях лицевого скелета и опорно-двигательного аппарата для восстановления костных дефектов.
Однако в результате уже первых испытаний очевидной стала проблема эффективного способа имплантации МСК в очаг поражения, т.к. в ряде экспериментальных исследований показано, что при введении МСК в кровеносное русло или непосредственно в место травмы, в последнем задерживаются лишь единичные клетки. Поэтому, разработка 3D материалов-матриксов носителей клеточных культур для иммобилизации МСК и последующей имплантации таких биоинженерных конструкций является актуальной задачей. К таким материалам-носителям клеточных культур предъявляются определенные биомедицинские требования. Они должны быть нетоксичны и биосовместимы; иметь такие параметры микрорельефа поверхности, которые обеспечивали бы оптимальные условия для адгезии, экспансии, миграции иммобилизованных на них клеток и, в результате, интимной связи имплантата с окружающими тканями; проявлять остеокондуктивные и остеоиндуктивные свойства; иметь кинетику резорбции, сопоставимую с кинетикой остеогенеза для наиболее полной утилизации материала-матрикса; быть пористыми для обеспечения эффективной неоваскуляризации образующейся de novo ткани.
Цель настоящего исследования - биомедицинские испытания in vitro и in vivo ряда пористых гранулированных кальцийфосфатных биокерамических материалов, синтезированных в ИПК РАН, и натурального коралла Acropora cervicornes как матриксов для клеточных культур. Использование наиболее перспективных образцов для создания биоинженерных конструкций (3D матрикс, насыщенный культурой аутологичных МСК) для замещения костного дефекта у экспериментальных животных.
Материалы и методы Исследования in vitro по оценке острой токсичности изученных образцов и динамики клеточной популяции при долгосрочном (до 28 суток) совместном культивировании выполнены на модели иммортализованных фибробластов человека (ФЧ). Метод оценки жизнеспособности клеток в динамике культивирования - МТТтест. Эксперименты in vivo по изучению биосовместимости материалов проведены на модели их подкожной трансплантации мышам линии BDF1.Через 1, 2, 4 недели, 3 и 6 месяцев образцы извлекали и, после декальцинации, проводили их гистологическое исследование с последующей световой микроскопией.
Исследование эффективности использования биоинженерных имплантатов для закрытия костного дефекта проведены на двух экспериментальных моделях: остеотомии голени крыс линии Wistar и сегментарной резекции большой берцовой кости барана. МСК крысы в экспериментах использовали в составе мононуклеарной фракции (МНФ), выделенной из костного мозга (КМ) лопаток и подвздошных костей. В день операции, после освобождения фракции от эритроцитов путем градиентного центрифугирования по стандартной методике на фиколл-верографине, мононуклеары тщательно отмывали в фосфатном буфере и насыщали (по разработанной методике) ими гранулированные пористые биокерамические матриксы - кремнийзамещенные гидроксиапатиты (КЗГА), бифазный материал гидроксиапатит-трикальциевый фосфат с процентным содержанием фаз 80/20 (ГА-ТКФ) и чистый ?-трикальциевый фосфат (?ТКФ). Затем, подготовленные таким образом материалы, имплантировали в зону дефекта. Для исследования биокерамических образцов каждого типа было сформировано 2 группы животных: контрольная группа с дефектами голени, в которые имплантировали соответствующие образцы материалов-матриксов и опытная - имплантация биокерамических материалов, насыщенных МНФ КМ.
Дополнительным общим контролем для этих экспериментов служила группа животных с травмой голени. Для исследования динамики закрытия костного дефекта всем оперированным крысам производили рентгенологическое исследование зоны операции через 3, 6, 9, 12 недель и 8 месяцев, в эти же сроки по 2 животных выводили из эксперимента (умерщвление с использованием эфирного наркоза) и производили гистологическое исследование препарата голени в области дефекта.
МСК барана выделяли из биоптата костного мозга, полученного при трипанбиопсии подвздошной кости. Далее, по разработанной в нашей лаборатории методике, получали первичную культуру МСК и осуществляли перепассирование для увеличения клеточной массы. На этапах культивирования проводили подсчет клеток, их морфологический анализ, оценивали наличие коммитированных в остео- и адипогенную линии предшественников, а также способность дифференцироваться в эти линии в специальных индукционных средах. Для получения биоимплантата использовали МСК барана III-IV пассажей и коралловый протез, представляющий собой цилиндр с выступами для фиксации в костномозговом канале. Равномерной иммобилизации МСК по поверхности кораллового протеза добивались путем совместного культивирования в роллерных бутылях. Подготовленную биоинженерную конструкцию имплантировали в зону дефекта и фиксировали выступами в костномозговом канале и, дополнительно, - титановыми пластинами на всем протяжении дефекта. Контролем в эксперименте на баране являлся аналогичный дефект большой берцовой кости с протезом из коралла без МСК. Животным производили рентгенологическое исследование трижды: накануне операции (для определения размеров протеза) и в динамике закрытия дефекта через 1 и 4 месяца после операции.
Далее после эвтаназии животного производили распил бедренной кости на фрагменты с последующим гистологическим исследованием материала. Все оперативные вмешательства и динамические рентгенологические обследования животных осуществляли под общей анестезией.
Результаты и обсуждение На первом этапе настоящего исследования в экспериментах in vitro на модели иммортализованных ФЧ была изучена острая токсичность (24 часа совместного культивирования) 10 различных образцов гранулированной пористой кальцийфосфатной керамики: бифазных материалов с варьируемыми в широких пределах соотношениями ГА и ТКФ, замещенных форм КЗГА, КГА, композиционных образцов ?ТКФ-?ТКФ, чистого ?ТКФ а также натурального коралла. Оценены матриксные качества их поверхностей по способности поддерживать активный рост и пролиферацию клеток при длительном (до 4-х недель) совместном культивировании. Показано, что все образцы материалов не токсичны для клеток - через 1 сутки культивирования к их поверхности прикрепляется и распластывается 80-90% от инициального пула ФЧ. Все испытанные образцы (за исключением композита ?ТКФ - ?ТКФ) обладали выраженными матриксными свойствами - за период наблюдения пул ФЧ увеличивался в 7,5-9,0 раз vs 5,0 в контроле (культуральный пластик полистирен). Для изучения биосовместимости в экспериментах in vivo было отобрано 4 биокерамических образца - ГА, ГА-ТКФ, КГА, КЗГА и натуральный коралл. Выявлено, что при подкожной трансплантации экспериментальным животным данные образцы не вызывают реакции воспаления со стороны окружающих тканей, т.е. являются биосовместимыми. Шероховатость поверхности этих материалов способствует активной миграции фибробластов с заселением отдельных их участков и формированием соединительной ткани уже через 2 недели после операции. Пористость создает условия для эффективной неоваскуляризации.
При динамическом наблюдении за процессом закрытия дефекта голени крысы с использованием биокерамических имплантатов (ГА-ТКФ, КЗГА, ?ТКФ) как без стволовых клеток, так и в составе биоинженерной конструкции (сроки - 2 нед.-6 месяцев) выявлена биорезорбция гранул разной интенсивности: наибольшая - для ?ТКФ, наименьшая - для КЗГА. Обнаружено, что все исследованные образцы обладают индуктивными потенциями разной степени выраженности. Общими для всех биокерамических имплантатов являются сроки восстановления костного дефекта: уже через 3 недели после операции в промежутках между и в полостях отдельных гранул наблюдаются очаги оссификации, в костно-мозговых лакунах - гемопоэз. К 6-й неделе эти процессы нарастают, вокруг гранул, попавших в верхнюю часть дефекта, образуется надкостница. К 9-й неделе остатки гранул вмурованы в костную ткань, через 12 недель гранулы кальций-фосфатной керамики (за исключением КЗГА) полностью резорбируются и замещаются зрелой костной тканью с формированием остеонов. В случае использования биоинженерной конструкции (биокерамические гранулы, насыщенные МНФ КМ) очаги оссификации в зоне дефекта выявляются, как минимум, на неделю раньше. По скорости биорезорбции и остеоиндуктивным качествам изученные биокерамические материалы могут быть представлены в следующей последовательности: КЗГА > ГА-ТКФ > ?ТКФ.
Использование в биоинженерных конструкциях аутологичной культуры МСК III пассажа, иммобилизованной на коралловом имплантате, для замещения обширного дефекта большой берцовой кости барана привело к более выраженному остеоиндуктивному эффекту по сравнению с контролем (коралловый имплантат в зоне дефекта).
Через 5 месяцев после операции в опыте получена полная консолидация конструкции с окружающими тканями. На гистологических препаратах в эти же сроки по всей толще имплантата отмечено активное костеобразование с формированием зрелых остеонов с параллельной резорбцией собственного вещества коралла.
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности клинического использования биокерамических и коралловых материалов-матриксов для клеточных культур в составе биоинженерных конструкций для замещения костных дефектов различного генеза.
См. также:
Тестирование культуры клеток печени эмбриона человека при физиотерапии экспериментального токсического гепатита
Физико-химическая регуляция in vitro пула стволовых кроветворных и стромальных клеток костного мозга
Эффект наноразмерных частиц и магнитного поля на колониеобразующую активность унипотентных кроветворных прекурсоров in vitro
Индукция апоптоза и пролиферации - иммунофизиологический механизм действия аллогенных прогенеторных клеток
Клеточные технологии для нейрорегенерации
Характер метилирования ДНК метафазных хромосом мезенхимных стволовых клеток человека
Аутологичная трансплантация кроветворных стволовых клеток при рассеянном склерозе: результаты исследования Российской кооперативной группы клеточной терапии
Резорбируемые матриксы из полиэфиров и гидроксиапатита для выращивания мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и реконструктивного остеогенеза
Разработка полимерных матриц для культивирования клеток кожи
Клиническая оценка отдаленных результатов трансплантации аутологичных стволовых клеток костного мозга у кардиохирургических больных с сердечной недостаточностью
...
Обсудить на форуме
