Цирятьева С.Б., Ю.Г. Суховей, Д.В. Трофимов, С.А. Петров
(Научно-исследовальский институт клинической иммунологии СО РАМН, Тюменский филиал; e-mail: tumiki@mail.ru)
Клинический эффект применения аллогенных прогенеторных клеток объясняется их неспецифическим механизмом действия. Введённые клетки, будучи мало дифференцированными, с помощью биологически активных веществ активизируют собственные эндогенные механизмы регуляции восстановительных процессов в «ущербных» органах путём регуляции дифференцировки клеток макрофагально - моноцитарного ряда и выделения ими собственных (эндогенных) регуляторных пептидов. Тем не менее, несмотря на перспективность применения фетальных протеинов в терапии различных нозологических единиц, следует констатировать недостаточный уровень изученности механизмов их действия на течение раневого процесса.
Цель исследования - изучить влияние аллогенных прогенеторных клеток на механизмы репаративной регенерации.
Материалы и методы:
Эксперимент выполнен на 80 половозрелых кроликах - самцах в стандартных условиях. Под общим обезболиванием на спине животного по паравертебральной линии формировали инфицированные раны мягких тканей. Через 5 суток начинали лечение. Животные были разделены на 4 группы: в экспериментальной группе на рану с 1 суток наносили аллогенные прогенетороные клетки в виде геля оригинального состава. После образования пленки из геля на рану накладывали стерильную салфетку. В группе контроля №1 на рану наносили только основу геля без аллогенных прогенеторных клеток. В группе контроля №2 лечение проводили традиционными методами. В группе контроля №3 лечение не проводилось. На 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 и 30 сутки оценивали размеры раневого дефекта, наличие отека, гиперемии, отделяемого из раны и его характер. В эти же сроки под местной анестезией выполняли биопсию раны через все слои на глубину до 1,8 - 2,2 см. Материал фиксировали в 96% этиловом спирте, заливали в парафин и готовили гистологические срезы, которые окрашивали гематоксилином Майера и эозином с последующим анализом морфологической картины. Парафиновые срезы обрабатывали ферментными иммунными комплексами с проведением внутреннего контроля иммуногистохимических реакций для выявления проапоптотического маркера CD95+ и маркера пролиферации Ki67.
Результаты исследования и их обсуждение.
До начала лечения раны неправильно округлой формы, размер составляет 3,9-4,1 см в диаметре. Вокруг раны очаг инфильтрации до 3,5 см в диаметре. Стенки раны плотные, спаяны с окружающими тканями, дно покрыто плотным налетом фибрина, выделяется до 2-3 мл гнойного отделяемого белесоватого цвета тестоватой консистенции. Глубина раны до 2 см. При гистологическом исследовании определяются очаги некроза в соединительной и мышечной ткани, расширение кровеносных сосудов со стазом крови, экссудация лейкоцитов. Клеточная инфильтрация представлена моноцитами, единичными макрофагами, единичными фибробластами, единичными моноцитами, плазмоцитами.
На 1 сутки эксперимента во всех группах раны сохраняют свои размеры. В группах контроля стенки раневых дефектов сохраняют свою плотность, спаяны с окружающими тканями, вокруг раны сохраняется плотный инфильтрат, при механическом воздействии из раны выделяется гной. Дно раны покрыто гнойной пленкой. При гистологическом исследовании определяется рыхлая соединительная ткань с большим количеством фиброцитов, фибробласты с неправильно - овальными ядрами и сетчатым рисунком хроматина, расположенным по периферии ядра образуют тяжи клеток. Очаги некроза замещаются полиморфно - ядерными лейкоцитами. В экспериментальной группе в 1 сутки после лечения края раневого дефекта мягкие, отека и инфильтрации не определяется, дно раны покрыто налетом фибрина с участками гнойного отделяемого. Гистологически расширение сосудов синусоидального типа со стазом крови, периваскулярно скопления моноцитов.
При иммуногистохимическом исследовании до лечения во всех группах выявляется высокий уровень CD95 10-12%. На 1 сутки эксперимента высокий уровень маркера CD95 - 10% - остается только в экспериментальной группе.
На 3 сутки в экспериментальной группе рана 0,2 - 0,3 мм в диаметре, к 5 - 7 суткам рана полностью закрыта первичным натяжением без соединительнотканного рубца. Микроскопически определяется многослойный плоский эпителий, подэпителиально определяется лимфоплазмоцитарная инфильтрация. К 10 - 15 сутки в экспериментальной группе констатировано полное закрытие раневого дефекта с ростом волос.
В группах контроля на 5-15 сутки в ранах сохраняются признаки некроза с гнойно-некротическим отделяемым из раны, появляются очаги грануляционной ткани. Закрытие раны с формированием грубого рубца происходит в группе контроля №2 к 18 - 20 суткам, в группах контроля №1, 3 к 30 - 33 суткам.
При иммуногистохимическом исследовании на 3 сутки в экспериментальной группе сохраняется высокий уровень CD95+ (7-8%) и нарастает уровень Ki67 (4-5%). На 5 сутки уровень Ki67 становится 5 - 10%, а CD95 5 - 8%. В группе контроля №1 наблюдается умеренный рост CD95 и Ki67, в группе контроля №2 на 3 - 5 сутки уровень маркеров не отличается от исходного.
До 15 суток эксперимента в экспериментальной группе сохраняется высокий уровень Ki67 (8-11%), в группах контроля уровень CD95 и Ki67 стремится к нулю (0-4%).
До начала лечения во всех группах наблюдаются признаки некроза мягких тканей в ответ на прямое воздействие повреждающего агента (травма + инфицирование) с замещением очагов некроза полиморфно - ядерными лейкоцитами, при этом также определяются и мононуклеарные лимфоциты.
В экспериментальной группе после применения аллогенных прогенеторных клеток очищение раны от гнойно - некротических тканей происходит в 1 - 3 сутки лечения, а эпителизация раневого дефекта заканчивается к 5 - 7 суткам эксперимента. В группах контроля очищение раны от гнойно - некротических тканей происходит к 15 - 20 суткам, закрытие раневого дефекта с формированием грубого соединительнотканного рубца - к 20 - 30 суткам.
Клинический эффект применения аллогенных прогенеторных клеток, наряду с динамикой маркеров апоптоза и пролиферации, позволяет сделать вывод об индуцирующем влиянии аллогенных прогенеторных клеток на течение процессов репаративной регенерации.
См. также:
Модель организации клинического центра клеточных технологий на примере реального коммерческого проекта в городе екатеринбурге с учетом swot-анализа положения дел в области исследований стволовых клеток в россии
Сравнительный анализ интрамиокардиальной аутологичной трансплантации постнатальных стволовых клеток из периферической крови и жировой ткани у больных в остром периоде инфаркта миокарда
Тестирование культуры клеток печени эмбриона человека при физиотерапии экспериментального токсического гепатита
Физико-химическая регуляция in vitro пула стволовых кроветворных и стромальных клеток костного мозга
Эффект наноразмерных частиц и магнитного поля на колониеобразующую активность унипотентных кроветворных прекурсоров in vitro
Клеточные технологии для нейрорегенерации
Разработка биоинженерных конструкций на основе аутологичных мезенхимальных стволовых клеток и наноструктурированных материалов-матриксов синтетических и природного происхождения с целью восстановления костных дефектов у экспериментальных животных
Характер метилирования ДНК метафазных хромосом мезенхимных стволовых клеток человека
Аутологичная трансплантация кроветворных стволовых клеток при рассеянном склерозе: результаты исследования Российской кооперативной группы клеточной терапии
Резорбируемые матриксы из полиэфиров и гидроксиапатита для выращивания мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и реконструктивного остеогенеза
...
Обсудить на форуме
