Поспелов Л.Е.1, Бочарова И.В.1, Демихова О.В.1, Гергерт В.Я.1,Станков Д.С.2, Приходько А.В.2, Авдиенко В.Г. 1, Поспелов А.Л.1, Исаев А.А.2, Ерохин В.В.
(1 - ГУ ЦНИИТ РАМН, Москва, РФ; 107567 г. Москва, Яузская аллея, дом 2; e-mail: citramn@onlain.ru, 2 - ОАО «Институт стволовых клеток человека», Москва, РФ)
Введение
Ряд научных публикаций свидетельствует о правомерности применения стволовых клеток при некоторых заболеваниях, в этиологии которых присутствует инфекционное начало (например, при ВИЧ инфекции) [Lane H. и соавт. 1990, Krishan A. и соавт.2005]. Известно, что восприимчивость к туберкулезной инфекции зависит от состояния иммунной системы организма [Авербах М.М. и соавт 1985]. Все иммунокомпетентные клетки возникают из клеток-предшественников (стволовых клеток) костного мозга. В связи с этим нами была выдвинута гипотеза, что введение аллогенных клеток костного мозга (ККМ) от резистентных к туберкулезу мышей может повысить сопротивляемость организма мышей чувствительной линии, зараженных микобактериями туберкулеза.
Целью работы было изучение возможности использования клеток костного мозга при лечении экспериментального туберкулеза у мышей. Для этого определяли показатели выживаемости животных после заражения, высеваемости микобактерий из органов зараженных животных, реакцию ГЗТ на туберкулин и специфический антительный ответ при трансплантации клеток костного мозга.
Материал и методы
Для экспериментальных исследований использовали мышей инбредной линии C57BL/6, чувствительной к туберкулезу и инбредной линии AKR резистентной к туберкулезной инфекции, содержащихся в питомнике ГУ ЦНИИТ РАМН. Клетки костного мозга получали из бедренной кости мышей линии AKR на холоду, суспендировали в среде 199, 1 раз отмывали в среде 199 и доводили до концентрации 6 млн клеток в 0,3 мл суспензии на 1 инъекцию на мышь.
Мышей линии С57BL/6 заражали смертельной дозой (1х107 КОЕ) микобактерий туберкулеза H37Rv (МБТ).
Все экспериментальные животные линии С57BL/6 были разделены на следующие группы:
1 группа - инфицированные животные, не получающие лечения - 10 шт.
2 группа - инфицированные животные, получающие противотуберкулезный препарат изониазид в дозе 38,5 мг/кг - 10 шт.
3 группа - инфицированные животные, получающие противотуберкулезный препарат изониазид в дозе 38,5 мг/кг и ККМ линии AKR (аллогенная трансплантация) - 10 шт.
4 группа - инфицированные животные, получающие только ККМ линии AKR (аллогенная трансплантация) - 10 шт.
5 группа - здоровые мыши, получающие только ККМ линии AKR (контроль безопасности аллогенной трансплантации) - 10 шт.
Изониазид вводили внутрижелудочно через 3 дня после заражения, ежедневно в течение 2-х месяцев, ККМ вводили внутривенно в хвостовую вену мышей также через три дня после заражения еженедельно в течение 2-х месяцев.
Иммуноферментный анализ проводили в 96-ти луночных планшетах, которые сенсибилизировали комплексным антигенным препаратом культурального фильтрата Mycobacterium tuberculosis H37Rv. В планшеты вносили сыворотки исследуемых животных в разведениях 1:400, 1:1600, 1:6400. После часовой инкубации и отмывки PBS-Tween в планшеты добавляли разведения вторых антител, меченых пероксидазой хрена, иммунопероксидазные конъюгаты, направленные против поливалентных IgG (Sigma, США), подклассов IgG1, IgG2a (ICN, США), IgM и IgA (Sigma, США). После окончания реакции, результаты считывали по оптической плотности при 450 нм.
Для изучения уровня специфического клеточного противотуберкулезного иммунитета ставили реакцию ГЗТ. Для этого в подушку одной из лап опытных животных вводили туберкулин, а в другую (контроль) - физиологический раствор и сравнивали уровень местной кожной реакции каждой из лап.
Результаты
Как показали исследования, у мышей контрольной группы, не получавших никаких препаратов, выживаемость после смертельной дозы заражения составила 24,8±1,42 дня. Мыши, получавшие ежедневно изониазид в течение 2-х месяцев (2-я группа), изониазид и клетки костного мозга одновременно (3-я группа) и только клетки костного мозга (4-я и 5-я группы) оставались живы в течение всего срока наблюдения - 6 месяцев.
Через 2 месяца после окончания лечения часть животных (по 3 мыши из каждой группы) была забита для оценки высеваемости микобактерий туберкулеза из органов мышей (остальные животные были оставлены для дальнейшего наблюдения). Результаты высеваемости микобактерий туберкулеза показали, что даже по прошествии 2-х месяцев после окончания трансплантации клеток костного мозга (группа 4), число микобактерий в органах было значительно снижено - (2,9±0,3)x105 по сравнению с животными без лечения - (2,6±0,4)х109, которые погибли через 24,8 дня. В группах с применением химиотерапии число колоний было значительно меньше-(5,8±0,6)х103 по сравнению с группой мышей, которым вводили только клетки костного мозга. Разница была статистически достоверна.
В таблице 1 приведены результаты исследования уровня специфических антител (оптическая плотность при 450нм) в сравниваемых группах зараженных животных. Как видно из приведенных данных, группа животных, получавших терапию аллогенным трансплантатом клеток костного мозга, имеет значительно более высокие значения уровня антимикобактериальных антител во всех исследуемых классах. Также высокие уровни антител наблюдаются и при исследовании антительного ответа по подклассам IgG: IgG1, IgG2a. Ответ IgG2a антител имеет явно более выраженный характер в сравнении с ответом IgG1 антител. Известно, что протективный противотуберкулезный ответ определяется ответом Th1, для которых характерна активная секреция антител IgG2a подкласса [Hovav A.и соавт. 2005, Wang Q. и соавт. 2004].
При изучении уровня специфического клеточного иммунитета показано, что он был самым низким при применении химиотерапии (Табл.2). Наиболее высокий специфический клеточный иммунный ответ, оцениваемый по реакции ГЗТ, обнаружен в группе зараженных мышей, которым вводили клетки костного мозга.
Заключение
В результате проведенных исследований использования клеток костного мозга в терапии экспериментального туберкулеза у мышей установлен протективный эффект в отношении туберкулезной инфекции, выражающийся в значительном увеличении жизни мышей и снижении роста микобактерий туберкулеза в организме зараженных животных. Также был установлен высокий уровень IgG2a антител в сравнении с уровнем IgG1 антител при терапии клетками костного мозга, который указывает на наличие Th1-ответа, носящий при туберкулезе явный протективный характер. Высокий уровень IgG2a антител коррелировал с высоким уровнем специфического клеточного иммунного ответа, оцениваемого по реакции ГЗТ.
Таблица 1. Уровень антимикобактериальных антител основных классов иммуноглобулинов и некоторых подклассов (оптическая плотность, M±m) у мышей, зараженных M.tuberculosis H37Rv, получавших в качестве иммунотерапии клетки аллогенного костного мозга, традиционную химиотерапию или сочетание двух подходов.
Таблица 2. Уровень специфического клеточного иммунитета при разных видах лечения.
См. также:
Применение фетальных и биологических материалов в лечении хронических гепатитов и циррозов печени
Перспективы развития национального законодательства российской федерации в области исследования и применения стволовых клеток
Применение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток для лечения больных с хронической сердечной недостаточностью
Роль ионов кальция в регуляции роста эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro
Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток при некурабельном рассеянном склерозе: реалии и перспектива
Получение пересеваемой клеточной культуры клеток Drosophila melanogaster, трансгенных по гену нейротрофического фактора млекопитающих NGF?
Стромальные клетки жировой ткани - ангиогенные свойства и терапевтический потенциал
Создание адекватного микроокружения для стволовых клеток должно определять эффективность технологий заместительной терапии
Клеточная терапия хронической критической ишемии нижних конечностей
Бизнес и стволовые клетки
...
Обсудить на форуме
