Макаров А.В.1, Волков А.В.1, Адамян Л.В.2, Зайратьянц О.В.2, Опаленов К.В.2, Смольнова Т.Ю.2, Яротская Е.Л.2, Арутюнян И.В.1, Ржанинова А.А.1, Гольдштейн Д.В.1
(1 - ЗАО «РеМеТэкс»; 2 - Кафедра репродуктивной медицины и хирургии МГМСУ; e-mail: makarov@iscct.ru)
Стрессовое недержание мочи у женщин - распространенное, тяжелое и мучительное в социальном плане заболевание, негативно отражающееся на всех категориях качества жизни - физической активности, психоэмоциональном статусе, трудоспособности, социальном и семейном функционировании. Современные подходы к коррекции этой патологии основаны на формировании поддерживающего или замыкающего уретру механизма - атрифициального третьего неконтролируемого сфинктера. Одним из малоинвазивных хирургических вмешательств является метод повышения внутриуретрального давления путем пара- или пери-уретрального введения различных объемоформирующих препаратов (гелей, паст) из различных материалов: коллагена, жировой ткани, силикона, политетраэтилена, тефлона. С развитием клеточных технологий появилась возможность использовать методы трансплантации клеток для коррекции стрессового недержания мочи. В настоящее время проводятся исследования в области создания тканевых эквивалентов, моделирующих слинговые операции. Однако введение одной лишь суспензии клеток не позволяет создать значительную по объему соединительно-тканную подушку.
В нашей работе разработан специальный комбинированный трансплантат для инъекционного введения. Он представляет собой культуру малодифференцированных стромальных клеток жировой ткани, иммобилизованных на желатиновой матрице-носителе. Стромальную фракцию клеток выделяли по стандартному протоколу из образцов жировой ткани объемом 0,5 мл, взятых у 11 крыс. Тест на выживаемость выявил, что при прохождении через иглу инсулинового шприца (диаметром 0,3 мм) сохранялось 93% живых клеток.
Эксперимент проводили на 28 крысах-самках линии Вистар массой 250-300 гр. В ходе работы строго соблюдали требования к проведению экспериментальных исследований на животных. Все крысы были разделены на 3 группы (контрольную, сравнения и основную) и выводились из эксперимента на 5-6-е, 12-21-е и 27-35-е сутки после однократного парауретрального введения между влагалищем и уретрой в мочеполовую и тазовую диафрагмы 300 мкг трансплантата или только его бесклеточного матрикса. В контрольной группе (10 животных) крысам вводили только бесклеточный матрикс, из них 3-м - методом парауретральной инъекции с помощью инсулинового шприца (результат изучали на 5-е сутки) и 7-и - парауретрально через небольшой разрез кожи слева между влагалищем и уретрой (3-х животных исследовали на 14-е, и 4-х - на 35-е сутки). В группе сравнения (10 животных) крысам производили парауретральную инъекцию клеточного аллотрансплантата. Морфологическое исследование проводили на 6, 21-е (по 3 животных) и 30-е сутки (4 животных). В основной группе (8 животных) парауретрально инъецировали клеточный аутотрансплантат, а исследование проводили на 5, 12-е (по 2 животных) и 27-е сутки (4 животных).
Иссеченные участки парауретральной ткани, включающие уретру и стенку влагалища, по общепринятой технологии фиксировали в 10%-ом нейтральном формалине и заливали в парафин.
Для иммуноморфологического исследования использовали мышиные моноклональные антитела к коллагену I типа (Abcam, UK), коллагену III типа (клон HWD 1.1, Bio Genex, USA) и белку Ki-67 (Novocastra, UK), вторичные биотининизированные антитела, стрептавидин-пероксидазный комплекс и раствор DAB (Novocastra, UK, BD Pharmingen, USA). Для проведения морфометрического анализа в парауретральной ткани в 20 полях зрения, при увеличении микроскопа х400 подсчитывали процентное содержание клеток с экспрессирующими антиген Ki-67 ядрами. При статистической обработке использовали критерий Стьюдента, различия между показателями считали достоверными при 5% уровне значимости (р<0,05).
Результаты исследования показали, что на 5-е сутки эксперимента в наблюдениях контрольной группы в области инъекции бесклеточного матрикса пролиферативная активность клеток соединительной ткани и слабо выраженного воспалительного инфильтрата была минимальной, антиген Кi-67 экспрессировали ядра 6,7±1,3% клеток.
В отличие от бесклеточного матрикса, алло- и аутотрансплантаты значительно модулировали локальную активность различных клеточных популяций, причем клетки трансплантатов длительно сохраняли свою жизнеспособность. На 6-е сутки имплантация аллотрансплантата приводила к повышению в 1,7 раз (по сравнению с контролем) пролиферативной активности клеток перифокальной к нему соединительной ткани, наряду с выраженной иммунной реакцией. Морфология клеточного и матриксного компонентов аутотрансплантата не отличалась от аллогенного, но пролиферативная активность клеток аутотрансплантата и окружающей его соединительной ткани была в 3,4 выше, чем при аллотрансплантации. Вокруг аутотрансплантата формировалась грануляционная ткань с множеством новообразованных капилляров, а микроциркуляторная и иммунная реакции были менее выражены.
В наблюдениях контрольной группы на 14-е сутки эксперимента было характерно формирование в области микротравмы небольших очагов склероза. Пролиферативная активность клеток соединительной ткани в очагах склероза была низкой. На 12-21-е сутки эксперимента в наблюдениях основной группы и группы сравнения отмечалась повышенная пролиферативная активность клеток алло- и, особенно (в 1,7 раз выше.), аутотрансплантатов, а также окружающей их соединительной ткани. Вокруг трансплантатов разрасталась грануляционная ткань, причем для аллотрансплантатов была характерна ее лимфо-макрофагальная инфильтрация с примесью лаброцитов и сходные по клеточному составу периваскулярные инфильтраты. Отмечалось накопление коллагена I и III типов, преимущественно перифокально к алло- и аутотрансплантатам и между фрагментами их матрикса.
На 35 сутки эксперимента в контрольных наблюдениях в парауретральной ткани отмечались лишь единичные, мелкие очаги склероза. Просвет уретры по своей ширине и форме не менялся. В основной группе и группе сравнения на 27-30-е сутки эксперимента выявлялось выраженное очаговое разрастание соединительной ткани, приводившее к сдавлению и сужению просвета уретры. На месте алло- и аутотрансплантатов, компоненты которых уже не определялись, формировались очаги рубцовой ткани, богатые коллагеном I и III типов, с конгломератами расширенных тонкостенных сосудов. В наблюдениях аллотрансплантации сохранялись очаговые лимфо-макрофагальные, нередко периваскулярные инфильтраты, а аутотрансплантации - выявлялись очаги грануляционной ткани с активным неоангиогенезом, группами липоцитов и поперечно-полосатых миоцитов.
Таким образом, экспериментально-морфологическое исследование результатов инъекционной имплантации в парауретральные ткани специально разработанных комплексных алло- и аутотрансплантатов показало, что клетки, особенно аутологичные, оказывают выраженное местное активирующее влияние на пролиферацию клеточных популяций соединительной ткани и длительно сохраняют свою жизнеспособность, пролиферативную и синтетическую активность. Механизм действия аллогенных клеток связан, вероятно, с инициацией пролиферативной активности собственных клеток рецепиента. Очаговое разрастание соединительной ткани в области имплантации как алло-, так и аутотрансплантатов, приводит к развитию локального сужения просвета уретры. Таким образом, использование инъекционной имплантации комбинированных алло- и аутотрансплантатов открывает перспективы для лечения повреждений тканей и других патологических процессов репродуктивной и мочевыводящей систем.
См. также:
Математическая модель аксонального роста в свободной полости и в пористой среде
Трансфекция мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) фактором роста эндотелия сосудов (VEGF)
Инфицированность кордовой крови и эмбрионов ранних сроков гестации
Инфицированность кордовой крови и возможные пути проникновения патогенных агентов в плод
Клетки кордовой крови и тканевые препараты в схеме лечения ожоговой болезни
Трансплантация аллогенных культивированных клеток в лечении экспериментальных глубоких ожоговых дефектов роговицы у кроликов
Влияние аутотрансплантации различных клеток костного мозга на состояние поврежденного миокарда в разные сроки после инфаркта
Применение фетальных и биологических материалов в лечении хронических гепатитов и циррозов печени
Перспективы развития национального законодательства российской федерации в области исследования и применения стволовых клеток
Применение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток для лечения больных с хронической сердечной недостаточностью
...
Обсудить на форуме
