Осипенко М. А., Межевикина Л.М., Петрова Р.Р.
(Институт биофизики клетки РАН; 142290, Пущино, Московской обл., ул. Институтская, д. 3, e-mail:minj@mail.ru)
Ионы кальция - ключевые регуляторы клеточных циклов, метаболической активности и дифференцировки разных типов соматических и эмбриональных клеток животных и человека. Кальций как вторичный мессенджер участвует практически во всех внутриклеточных процессах. Особенно велика его роль в эмбриогенезе (7, 10, 14). Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) в системе in vitro воспроизводят раннее развитие и дифференцируются во все типы клеток взрослого организма (9, 12, 13). Достигается это путем подбора соответствующих условий культивирования, в том числе и ионного состава среды. Есть данные о том, что сдвиг баланса ионов свободного кальция в системе «клетка-среда» влияет на процессы развития ЭСК млекопитающих (1).
В частности, показано, что при увеличении внутриклеточного кальция снижается вероятность гибели ЭСК мыши по механизму апоптоза и повышается их выживаемость in vitro (2, 11). Варьируя соотношение внутри- и внеклеточного кальция можно влиять на процессы дифференцировки стволовых клеток мыши в хондроциты, остеоциты и другие типы клеток костной и хрящевой ткани (3, 4, 6). Изменение баланса по кальцию может вызывать также и кардиомиоцитарную дифференцировку (8).
Целью наших исследований было выявление характера влияния ионов свободного кальция в среде культивирования на рост ЭСК мыши, а также выявление роли кальциевых каналов и активаторов кальциевого тока в регуляции пролиферативной активности клеток.
Мы использовали клетки линии R1 (5), которые выращивали по стандартной методике на планшетах (Nunc), предварительно обработанных 0.1% раствором желатины (Sigma). В среду ДМЕМ (ПанЭко) добавляли 15% фетальной сыворотки коров (HyClone) и 20 мкл/мл (v/v) цитокина LIF. ЭСК культивировали в ДМЕМ с разным содержанием ионов свободного кальция. Концентрации 10-3, 10-5 и 10-7 М кальция в среде поддерживали за счет добавления Ca2+-EGTA буферных растворов (Sigma). Использовали также 10-7 М нифедипин - блокатор кальциевых каналов, и 10-7 М кальциевый ионофор А23187. Пролиферативную активность оценивали через 24, 48 и 72 ч путем прямого подсчета клеток с 0.5% трипановым синим для выявления клеточной гибели в результате нарушения проницаемости плазматических мембран.
Обнаружена слабая зависимость пролиферативной активности клеток линии R1 от концентрации ионов кальция в среде культивирования (рис.).
Для этого типа клеток снижение кальция в среде до 10-5М не вызывает достоверного увеличения клеточной гибели и не влияет на продолжительность их клеточных циклов (рис., кривая 3). При такой концентрации клетки сохраняют способность размножаться в виде колоний без признаков морфологической дифференцировки. Снижение содержания кальция до 10-7М, а также увеличение до 10-3М в буферной среде с EGTA приводит к увеличению времени удвоения клеточных популяций и задержке развития ЭСК (рис., кривые 4, 5). В бескальциевой среде эти клетки теряют способность к адгезии и переходят в суспензию (рис., кривая 6).
Рисунок. Пролиферативная активность эмбриональных стволовых клеток линии R1 в зависимости от концентрации ионов кальция: 1 - 10-7М А23187, 2 - контроль (10-3М Ca2+), 3 - Са-5М+EGTA, 4 - Са-3М+EGTA, 5 - Са-7М+EGTA, 6 - без кальция (3х10-3М EGTA), 7 - 10-7М нифедипина в среде культивирования.
При использовании 10-7М нифедипина, блокатора кальциевых каналов, значительно тормозится скорость роста и возрастает клеточная гибель (рис., кривая 7). Активатор кальциевого тока, ионофор А23187, наоборот, положительно влияет на ЭСК мыши. Он способствует более быстрому достижению стационарной фазы роста, по сравнению с контролем (рис., кривая 1, 2). Стимулирующее действие ионофора А23187, связано, прежде всего, с увеличением потока ионов кальция в цитоплазму из среды и внутриклеточных депо. Таким образом, активность кальциевых каналов и Са2+-транспортных систем способствует пролиферации и выживаемости ЭСК мыши in vitro. Функциональное значение этого иона для ЭСК заключается в поддержании жизнеспособности и воспроизводства и, в целом, отражается на динамике их развития.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 05-04-49521 и НШ-1842. 2003.4
Литература
Fink C.C., Slepchenko B., Moraru I.I. et. al. An Image-Based Model of Calcium Waves in Differentiated Neuroblastoma Cells. Biophysical J., 2000. V. 79. P. 163-183.
Fanelli С., Coppola S., Barone R. et al. Magnetic fields increase cell survival by inhibiting apoptosis via modulation of Ca2+ influx. FASEB J., 1999. V. 13. P. 95-102.
Jiang Y, Jahagirdar B.N., Reinhardt R.L., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature, 2002. V. 418. P. 41-49.
Mello P.A. et al. Effect of Strong Magnetic Fields on Primary Cortical Neurons, Physica Scripta, 2005. V. 118. P. 205-207.
Nagy A., Rossant J., Nagy R. at al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993. V. 90. P. 8424-8428.
Orkin S.H., Morrison S.J. Stem-cell competition. Nature, 2002. V. 418 P. 25- 27.
Rogers N T, Hobson E, Pickering S et. al. Phospholipase Cz causes Ca21 oscillations and parthenogenetic activation of human oocytes. Reproduction, 2004. V. 128. P. 697-702.
Sauer H., Rahimi G., Hescheler J. et. al. Effects of electrical fields on cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. J. Cell. Biochem., 1999. V. 75. P. 710-723.
Schuldiner M., Yanuka O., Itskovitz-Eldor J. et al. Effect if eight growth factors on the differentation of cells derived from human embryonic stem cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2000. V. 97. P. 11307-11312.
Stachecki J.J., Armant D.R. Transient release of calcium from inositol 1,4,5-trisphosphate-specific stores regulates mouse preimplantation development. Development, 1996. V. 122. P. 2485-2496.
Tonini R., Baroni M.D., Masala E.M. et al. Calcium Protects Differentiating Neuroblastoma Cells during 50 Hz Electromagnetic Radiation. Biophys. J., 2001. V. 81. №. 5. P. 2580-2589.
Ventura C., Maioli M., Asara Y. et al. Bytyric and retinoic mixed ester of hyaluronan: a novel differentiating glycoconjugate affording a high throughout of cardigenesis in embryonic stem cells. J. Biol. Chem., 2004. V. 279. № 22. P. 23574-23579.
Wobus A.M., Kaomei G., Shan J. et al. Retinoic acid accelerates embryonic stem cell-derived cardiac differentation and enhances development of ventricular cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol., 1997. V. 29. P. 1525-1539.
Xiao L.-J., Yuan J.-X., Li et. al. Extracellular Ca21-sensing receptor expression and hormonal regulation in rat uterus during the peri-implantation period. Reproduction, 2005. V. 129. P. 779-788.
См. также:
Трансплантация аллогенных культивированных клеток в лечении экспериментальных глубоких ожоговых дефектов роговицы у кроликов
Влияние аутотрансплантации различных клеток костного мозга на состояние поврежденного миокарда в разные сроки после инфаркта
Применение фетальных и биологических материалов в лечении хронических гепатитов и циррозов печени
Перспективы развития национального законодательства российской федерации в области исследования и применения стволовых клеток
Применение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток для лечения больных с хронической сердечной недостаточностью
Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток при некурабельном рассеянном склерозе: реалии и перспектива
Получение пересеваемой клеточной культуры клеток Drosophila melanogaster, трансгенных по гену нейротрофического фактора млекопитающих NGF?
Стромальные клетки жировой ткани - ангиогенные свойства и терапевтический потенциал
Создание адекватного микроокружения для стволовых клеток должно определять эффективность технологий заместительной терапии
Клеточная терапия хронической критической ишемии нижних конечностей
...
Обсудить на форуме
