Нами были испытаны четыре ингибитора транскрипции с разными механизмами действия - актиномицин-D, оливомицин, а- и Р-аманитины. Влияние актиномицина обусловлено уникальным сочетанием стереохимических свойств ДНК и ингибитора, который, располагаясь в малой борозде двуспиральной ДНК, образует водородные связи с 2-аминогруппой гуанина одной цепи и ортофосфатом другой, тем самым препятствуя расплетению ДНК и продвижению вперед РНК-полимеразы. Ингибирующее влияние оливомицина также обусловлено образованием комплекса одновременно с двумя цепями ДНК и блокировкой продвижения РНК-полимеразы. Однако в отличие от актиномицина оливомицин преимущественно подавляет транскрипцию долгоживущих информационных РНК(иРНК), мало влияя на синтез короткоживущих иРНК. Нетрудно заметить, что первичной «точкой приложения» обоих указанных ингибиторов служит матрица (ДНК)- Известны лишь немногочисленные ингибиторы, непосредственно взаимодействующие с ферментом - РНК-полимеразой. Одними из них являются соединения из класса аманитинов. Особый интерес к этим препаратам обусловлен еще и тем, что они избирательно подавляют активность РНК-полимеразы Б, ответственной за синтез иРНК (Ашмарин, Ключарев, 1975).
Прежде чем приступить к изучению влияния ингибиторов на ПЖ, представлялось важным установление рабочего диапазона доз и динамики ингибирующего действия в конкретных условиях наших опытов. С этой целью в предварительных опытах были установлены токсические дозы, и последующий поиск проведен 6-8 разными дозами примерно в 103-106 раз меньше токсических. Степень и динамику ингибирующего влияния изучали в трех разных дозах, соответствующие кривые которых для актиномицина-D приведены на рис. 27. При малых дозах (0.1 мкг/мл) уровень биосинтетических процессов возвращается к исходному уровню в течение первой недели; при средних (1 мкг/мл) - в течение второй недели, а при больших дозах (10 мкг/мл) продолжает оставаться примерно вдвое ниже исходного в течение всего исследуемого срока. При более длительных экспозициях наблюдаются сложные фазные изменения ОУР РНК и белка. Эти факты позволяют заключить, что в исследованном диапазоне доз актиномицин оказывает непосредственное влияние на интенсивность транскрипции и трансляции, однако характер этого влияния зависит от дозы и длительности экспозиции и трудно предсказуем при длительных экспериментах.
Исследования, проведенные с целью изучения геропротекторного эффекта актиномицина и оливомицина, показали, что в оптимальном диапазоне доз эти ингибиторы способны увеличить ПЖ дрозофил на 10-25 % (рис. 28).
Рис. 27. Влияние актиномицина-D в до зах О I мг/мл (/), 1 MI/мл (2), 10 мг/мл (3) на интенсивность биосинтеза РНК (Л) и белка (Б) у дрозофил линии D-18.
Рис. 28. Влияние разных доз (Д, мкг/мл) актиномицина-D (Л) и оливомицина (Б) на СПЖ и МПЖ дрозофил линии D 18.
Так, почти все исследованные дозы актиномицина до 1 мкг/мл приводили к увеличению СПЖ и МПЖ Регрессионные > равнения для СПЖ и МПЖ (сут) и дозы (Д, мкг/мл) актиномицина-D имели вид:
Из коэффициентов регрессии этих уравнений видно, что актиномицин-D оказывает более сильное влияние на МПЖ, чем на СПЖ. Пролонгирующий жизнь эффект оливомицина был примерно такого же порядка и сохранялся вплоть до дозы 100 мкг/мл. Соответствующие регрессионные зависимости имели вид:
Из представленных уравнений видно, что оптимальные дозы оливомицина почти на два порядка выше, чем актиномицина, что, вероятно, объясняется меньшей степенью очищенности и устойчивости препарата при приготовлении питательной среды с добавками ингибитора.
В оптимальных дозах а- и (3-аманитин также приводили к некоторому снижению смертности. Так, к 25-м суткам в группе контрольных дрозофил погибало 32 %, а при дозах а-аманитина 0.032 и 0.1 мкг/мл - по 17 %. Аналогичные величины для |3-аманитина составляли 12 и 23 % соответственно.
Таким образом, в оптимальных дозах исследуемые ингибиторы транскрипции приводили к увеличению ПЖ на 10-25 %. Эффект влияния актиномицина удается обнаружить как для СПЖ, так и для МПЖ, а оливомицина - только для СПЖ. Возможно, ингибируемые оливомицином преимущественно долгоживущие молекулы иРНК не так существенны для старых м\х и МПЖ практически не зависит от дозы оливомицина.
Как и в опытах с ингибиторами транскрипции, нами были испытаны четыре ингибитора трансляции - циклогексимид, тетрациклин, пуромицин и сернокислый гидроксиламин. Из них циклогексимид - один из наиболее «многопрофильных», подавляет несколько реакций инициации и элонгации, причем элонгацию - при высоких дозах. Задерживая освобождение деацилированной тРНК из донорного участка рибосом, циклогексимид подавляет транслокацию, оставляя недостроенную полипептидную цепь, связанную с рибосомами. Тетрациклин считается специфическим ингибитором элонгации. Блокируя центр связывания аминоацилтРНК, он останавливает дальнейшее считывание иРНК, не нарушая комплекс иРНК-рибосомы. Пуромицин - также ингибитор элонгации. Однако действуя как конкурентный аналог аминоацилтРНК, он подменяет очередную аминоацил-тРНК, в результате чего полипептидная цепь прерывается и недостроенная молекула белка сходит с рибосом. Нетрудно заметить, что при действии всех указанных ингибиторов трансляции образуются нефункциональные комплексы иРНК-рибосомы или недостроенные полипептиды, которые могут нарушить нормальный ход работы аппарата биосинтеза белка. Поэтому результирующее их влияние на ПЖ может быть различно в зависимости от соотношения положительного геропротекторного эффекта и отрицательных последствий накопления нефункциональных рибосом и белков. В этом плане более привлекательным представляется другой использованный нами ингибитор трансляции - гидроксиламин. Известно, что первая аминокислота любой вновь строящейся полипептидной цепи - формилметионин, который образуется ферментативным форматированием метионин-тРНК Гидроксиламин считается специфическим ингибитором этого процесса Поскольку ингибитор действует на одном из начальных этапов трансляции, то многие считают его наиболее экономным и близким к естественным механизмам регулятором биосинтеза белка (Ашмарин, Ключарев, 1975).
Результаты влияния ингибиторов трансляции на ПЖ дрозофил приведены на рис. 29, из которого видно, что все изученные дозы циклогексимида, тетрациклина и пуромицина приводили к сокращению ПЖ. Так, в диапазоне 0.1 -100 мкг/мл между СПЖ или МПЖ (сут) и дозой (Д, мкг/мл) циклогексимида существовала зависимость следующего вида:
Из представленных коэффициентов корреляции и регрессии видно, что сокращающее ПЖ влияние циклогексимида более выражено для СПЖ. Эта закономерность сохраняется и в опытах с тетрациклином, для которого были обнаружены зависимости следующего вида:
Более слабое влияние на МПЖ было особенно характерно для пуромицина:
Из этих уравнений, например, следует, что, если по мере увеличения дозы пуромицина на каждый мкг/мл СПЖ снижается на 1 %, то МПЖ при этом сокращается всего на 0.01 %.
Из всех изученных ингибиторов трансляции только гидроксиламин приводил к увеличению ПЖ, которое в диапазоне 0.1 - 100 мкг/мл описывалось уравнениями:
Таким образом, опыты с четырьмя разными по механизму действия ингибиторами трансляции показали, что, судя по величинам коэффициентов регрессии и корреляции, все они оказывают статистически достоверное влияние на СПЖ, мало влияя на МПЖ. Причем под влиянием циклогексимида, тетрациклина и пуромицина, ингибиторное действие которых связано с образованием нефункциональных комплексов и пептидов, СПЖ сокращается. Только при добавлении гидроксиламина, механизм действия которого близок к естественным клеточным регуляторам биосинтеза белка, наблюдается увеличение ПЖ..
Рис. 29. Влияние разных доз (Д, мкг/мл) ингибиторов трансляции на СПЖ и МПЖ дрозофил линии D-18.
А - циклогексимид, Б - тетрациклин, В - пуромицин, Г - гидроксиламин.
Разумеется, возможны и другие объяснения обнаруженных фактов, тем более что ряд ингибиторов трансляции (морфоциклин, тетрациклин и стрептомицин) увеличивал ПЖ домашних мух (Юделева, 1977). Биосинтез белка - сложный, многоступенчатый процесс, интенсивность его можно регулировать как минимум в 11 ключевых точках, из которых 5 приходятся на долю ядерных этапов, 5 - цитоплазматических и 1 - промежуточного (перенос иРНК из ядра в цитоплазму) (Газарян, Тарантул, 1983). Естественно, что подавление какого-то одного этапа специфическим ингибитором может привести к компенсаторному росту других. В частности, при применении ингибиторов трансляции могут активироваться ядерные этапы, и наоборот. Для проверки такой возможности нами были поставлены опыты с чередованием ингибиторов транскрипции и трансляции или одновременным их добавлением в питательную среду. Однако во всех этих сериях опытов пролонгирующий эффект или отсутствовал, или не превышал результата, полученного на одном из использованных ингибиторов. Эти данные позволяют заключить, что применение ингибиторов биосинтеза белка с разными «точками приложения» не обеспечивает аддитивного эффекта пролонгирования жизни. Возможно, влияние ингибиторов транскрипции и трансляции в длительных экспериментах имеет сложный фазный характер с малой вероятностью суммирования геропротекторного эффекта. Обращает на себя внимание также то, что использованные ингибиторы транскрипции оказались более эффективными, чем ингибиторы трансляции. Это может быть следствием и, возможно, одновременно доказательством ведущей роли генорегуляторных и структурных изменений генома в генезе старения.
Таким образом, проведенные на дрозофилах эксперименты показали, что ряд ингибиторов биосинтеза белка может привести к увеличению ПЖ. Вместе с тем сравнительно скромный прирост ПЖ заставляет обратить внимание на известный факт, что ПЖ дрозофил соизмерима с периодом полужизни многих полипептидов, и в течение имагинальной жизни обновляется только определенная часть белков (Clark, Smith, 1966). С этой точки зрения короткоживущие биологические объекты являются недостаточно корректными моделями для изучения влияния ингибиторов биосинтеза белка на ПЖ. Поэтому для раскрытия истинных геропротекторных возможностей ингибиторов биосинтеза белка опыты на крысах представляются более корректными и практически важными.
См. также: 
Влияние оливомицина на ПЖ крыс.
Обсудить на форуме
