Мы решаемся предложить модель, как нам кажется, наиболее непротиворечивого механизма онтогенеза. Модель основана наследующих фактах:
Во-первых, количество синтезируемого клеткой белка (трансляция) на цитоплазматическом уровне, как известно, отражает в основном внутриклеточную концентрацию М-РНК [136] и Р-РНК [137], втом числе, конечно, и Т-РНК. На уровне генетического аппарата ядра «количество образующегося конечного продукта - белка или РНК - зависит от дозы, т.е. числа копий данного гена» [138, 139, 140].
Во-вторых, как известно, основными неспецифическими ингибиторами матричной активности, репрессорами генетического аппарата считаются ги стоны [141]. (Например, установлен конкретный факт репрессии транскрипции гистоном H1 [142] или Н3).
Предположение о том, что гистоны регулируют активность генов, репрессируя их, было высказано в 1950 г. Стедман Е. и Стедман Е. (Удаление гистонов из ДНП комплекса сопровождается стимуляцией транскрипции [143|).
В-третьих, в геноме животных к многоповторяющнмся (многокопийным) генам относятся гены T-PHК, Р-РНК, гены рибосомальных белков и гены гистонов.
Например: Фабрикой по синтезу белков являются рибосомы. В клетке человека 200 копий рибосомных генов образуют 5 кластеров, расположенных на хромосомах 13-15,21 и 22. Транскрипты рибосомных генов составляют, примерно, половину всех молекул РНК, синтезируемых клеткой.
Идентичные копии каждого из пяти генов гистонов повторяются в геноме многоклеточных организмов от десятков до сотен раз. Такая высокая повторяемость копий однотипных генов гистонов обеспечивает им (в отличии от структурных генов с единичными повторами) преобладающий синтез на протяжении всего онтогенеза.
Эволюционная консервативность и мономорфизм гистонов поразительны. Гистоны сходны в различных тканях и у очень широкого круге видов [144, 145], что является дополнительным доказательством фило- и онтогенетической неспецифичности (универсальности) механизма репрессии ги-стонами генетического аппарата в многоклеточных организмах.
В-четвертых, в процессе развития и с возрастом характер организации нуклеотидных последовательностей наследственного аппарата не изменяется [43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 146].
Результаты ряда исследований согласуются с представлением о том, что ДНК клеток каждого вида содержит всю информацию, необходимую для синтеза всех белков этого вида, однако, в тканях определенные участки ДНК репрессированы гистонами, и в результате образуются лишь белки, характерные для данной ткани [147]. Т.е. постоянство генома отмечается на всем протяжении онтогенеза, что, как уже сказано, было установлено прямыми опытами Gurdon J.B. (1962, 1974) [148], WflmutI. и др. (1997) [130] по трансплантации ядер дифференцированных клеток в энуклеированные яйцеклетки.
Опыты с пересадками ядер из дифференцированных клеток в ооциты показывают не только то, что дифференцировка обратима, но и то, что обратимость эта не может быть вызвана ничем иным, кроме цитоплазмати-ческого окружения, поставляемого пересаженному ядру ооцитом [149].
Последнее, четвертое, условие для наших рассуждений, однако, не является обязательным, поскольку представляемая нами теория остаётся в силе, даже если бы генетический аппарат в клетках организма изменялся в процессе старения. Интересно также отметить, что на этот процесс есть своеобразный взгляд Рихарда Гольдшмидта, считающего, что во всех клетках одинаково работают все гены, а селективный отбор в разных частях зародыша происходит, так сказать, пост-транскрипционно. Для наших рассуждений важен и тот факт, как это покажем ниже, что репрессия генома гистонами является главным движителем дифференциальной репрессии в процессе всего развития.
Основные положения предлагаемой модели следующие:
1. Высокая повторяемость копий генов гистонов обеспечивает им, в отличие от структурных генов с единичными повторами своих копий, преобладающую мощь синтеза на протяжении всего онтогенеза.
2. Репрессия генома гистонами начинается с самых первых этапов эмбриогенеза, и здесь интенсивность ее наивысшая.
3. Начальный интенсивный этап репрессии способствует быстрой диф-ференцировке клеток в процессе исходного развития.
Ключевой закономерностью в объяснении процесса эмбриогенеза при этом становится принцип системного подхода, по которому нарастание качественного разнообразия (дифференцировка) и количественный рост числа клеток на начальных этапах онтогенеза обусловливает - подобно тому как это происходит в процессе исторического развития экосистем [4], -нарастание устойчивости системы организма в целом. Т.е. общая устойчивость признаков выступает не как свойство генов, а как выражение взаимозависимости частей (И.И. Шмальгаузен) [150].
В результате, например, в филогенезе и по мере роста сложности индивидуального развития организмов, в геноме их клеток частота обменов в среднем на единицу ДНК уменьшается, резко снижается трансформация и трансдукция [151]. В филогенезе частота кроссинговера у высших эукариот в сравнении с прокариотами уменьшена в 10 тыс. раз.
5. В дальнейшем вследствие непрекращающегося синтеза гистонов репрессия наследственного аппарата продолжается (хотя, возможно, и с меньшей интенсивностью), обусловливая процессы старческой инволюции генома.
В частности, например, в процессе развития головного мозга млекопитающих нервные клетки накапливают линкерные (Н1°) и коровые (Н3*3) гистоны. При этом, концентрация транскриптов этих белков в постмитотических клетках снижается, несмотря на транскрипционную активность соответствующих генов. Предполагается, что экспрессия генов этих гистонов регулируется посттранскрипционными компонентами и клеточными факторами, влияющими на стабильность М-РНК и/или трансляцию [152], т.е. речь идёт о реакции организма как целостной системы, противодействующей старению.
* * *
В подтверждение предлагаемой нами модели приведем несколько примеров.
При развитии зародыша (вьюна) от стадии бластулы к гаструле отмечено существенное снижение доли транскриптов с повторяющихся последовательностей ДНК [153]. Много ранее на этом же объекте в ходе раннего развития было установлено снижение тотальной транскрипционной активности генетического аппарата [154]. Аналогичные выводы были сделаны при изучении ряда других развивающихся систем. Например, анализ эмбрионов морского ежа показал, что большое разнообразие М-РНК на стадии гаструлы прогрессивно снижается на более поздних стадиях развития [155].
Сравнение гетерогенной ядерной РНК, синтезирующейся в эритроидных клетках по мере их созревания, показывает, что в них доля транскриптов (как отражение матричной активности генома) уменьшается в ряду эритробласт - ретикулоцит - эритроцит [156]. Подобные же результаты получены на дифференцирующихся миобластах [156].
Способность синтезировать РНК в ходе развития эритроцитов снижается в 8 раз [157].
При образовании мышечных волокон из миобластов скорость синтеза Р-РНК снижается в 5-10 раз [158].
Наблюдаемая специализация, например, в синтезе проколлагена при развитии эмбриона (цыпленка) обусловлена в основном потерей или инактивацией М-РНКдля неколлагеновых белков [159].
Специализированные клетки, находящиеся в состоянии терминальной дифференцировки, характеризуются резким сужением спектра синтезируемых белков и выраженным количественным преобладанием какого-либо
индивидуального белка в составе массы синтезируемых белков [137]. К примеру, появление множества копий ограниченного числа фракций М-РНК в поджелудочной железе происходит параллельно с формированием её секреторной функции в онтогенезе [137].
Одновременно показано, что скорость синтеза гистонов в эмбрионах (земноводных) на стадии двух клеток в 10 раз выше скорости их в ооците, а в период от двух клеточной стадии до стадии бластулы скорость синтеза гистонов возрастает еще в 3 раза [160].
На стадии дробления эмбрионов (морского ежа) гистоны составляют 25-30% вновь синтезируемых белков, а М-РНК гистонов - почти 70% всех М-РНК.
В позднем онтогенезе вследствие непрекращающегося и преобладающего синтеза гистонов происходит дальнейшее снижение количества транскрибируемых генов. При этом с возрастом увеличивается количество гистонов и понижается содержание негистоновых белков в дезоксирибонуклеопротеидном (ДНП) комплексе [161, 162, 163, 164].
Снижение транскрипционной активности хроматина всегда связано с увеличением в нем гистеновых белков [165].
Например, снижение матричной активности генетического аппарата в процессе постнатального развития сердечной мышцы (крысы) связано с повышением соотношения гистоны/ДНК [166].
В процессе постнатального развития печени (крысы) в хроматине увеличивается содержание гистонов и уменьшается содержание негистоновых белков [165].
Хотелось бы подчеркнуть, что к настоящему времени получено прямое доказательство правильности предлагаемой нами модели. Исследованиями [168, 169] показано, что ядрышковый (область высокой транскрипции) хроматин ряда изученных организмов составлен главным образом из свободной от гистонов ДНК. Нуклеосомо-подобную организацию, т.е. комплекс ДНК-гистоны, имеют лишь некодируемые участки генов. Иначе говоря, в транскрипционно активном хроматине гистонов нет, или количество их снижено, или связь гистонов с ДНК ослаблена. Наличие или отсутствие нуклеосом коррелирует с транскрипционным статусом гена: нуклеосомы выявляются только в транскрипционно неактивных генах [170].
По-видимому, имеет место разная степень плотности (прочности) связывания гистонов с ДНК (помимо нарастания этой прочности с возрастом) в различных частях генома и при различных физиологических процессах, поэтому полученное опытным путём заключение А. Д. Мирзабекова о том, что в активном хроматине нуклеосомы остаются частично связанными с ДНК, сохраняют свою первичную организацию и обогащаются белками
HMG-14/17. в принципе не противоречит, а только подтверждает выше сказанное и все то, что будет изложено в дальнейшем. Для нас основным фактом остаётся главное - нарастание с возрастом количества гистонов в ДНП
комплексе, одновременно, как это показано в ряде исследований, с возрастом в ДНП комплексе снижается количество негистоновых белков, в частности HMG-14/17. Кратко напомним морфологию хроматина. Хроматин - цепь фрагментов
ДНК длиной по ~ 146 н.п., навёрнутых на гистоновые октамеры (коровые нуклеосомы), состоящие из тетрамера (Н3+Н4)2 и двух димеров
(Н2А+Н2В). Эти фрагменты соединены короткими 20-60 н.п. линкерными участками ДНК, связанными с HI или белками HMG. Цепь ДНК с нук-леосомами упакована в фибриллы диаметром 30 им, которые, в свою очередь, образуют петли или домены. Домены фиксированы на белковом скелете ядра, который называют также ядерным матриксом.
Размер петель варьируется от 20 до 200 т.п.н., и множество отдельных генов и групп родственных генов организованы в отдельные петли.
Репликоны также имеют отношение к петельной организации ДНК: участки начала репликации часто совпадают с участками прикрепления ДНК к ядерному матриксу. Размер доменов, как правило, совпадает с размером репликонов. Петли ДНК прикреплены к ядерному матриксу в специфических участках, называемых участками прикрепления петель. Они обладают довольно сложной структурой и могут состоять из нескольких элементов, например, из участков взаимодействия с ДНК-топоизомеразой-2.
Различают два типа доменов генома: 1). функциональные домены - единицы транскрипции (транскриптоны) и единицы репликации (репликоны), и 2). структурные домены.
Наиболее чётко охарактеризованными структурными доменами являются предпочтительно чувствительные к нуклеазам области. Такие области могут включать один или несколько (часто функционально сцепленных) генов и межгенные пространства. Закреплённые на ядерном матриксе петли ДНК по размерам сопоставимы со средними размерами ДНКаза-чув-ствительных доменов.
Существенная роль в репрессии хроматина и его конденсации отводится гистону Н1. После синтеза гистон Н1 подвергается постсинтетическим обратимым модификациям: ацетилированию, фосфорилированию, АДФ-рибозилированию. АДФ-рибозилирование сопровождается деконденсацией хроматина его высших структур. Ацетилирование уменьшает положительный заряд аминогрупп и, следовательно, ведёт к ослаблению взаимодействия белка с ДНК, поскольку повышение аффинности белков к ДНК связано с увеличением суммарного положительного заряда. В свою очередь, фосфорилирование также уменьшает кооперативность связывания Н1 с ДНК.
HI препятствует посадке транскрипционных факторов. HI предпочитает связываться с более длинными фрагментами ДНК, и в транскрипционно неактивных клетках отмечается увеличение линкерной ДНК.
Итак, присутствие обогащенных аргинином линкерных белков и большая длина линкерной ДНК обеспечивают плотную упаковку нуклеосом и суперкомпактное состояние хроматина в транскрипционно неактивных клетках. Гетерохроматизация же хромосом (потеря их активности) является ключевым фактором старения.
Опубликованы работы, которые показывают, что потеря нуклеосом является не следствием, а причиной инициации транскрипции in vivo [171].
Последними исследованиями показано, что первая стадия перестройки хроматина при инициации транскрипции - это связывание транскрипционного активатора с нуклеосомной ДНК матрицей (при ацетилировании нуклеосом), что ведет к полному разрушению структуры нуклеосом без вытеснения гистонов [172].
Как выше сказано, потеря нуклеосом является не следствием, а причиной инициации транскрипции in vivo.
При реконструкции хроматина в различных вариациях гистонов восстановление нуклеосом полностью угнетает транскрипцию РНК-полимера-зой 2, причем гистон HI является сильным ингибитором, транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой [173], поскольку РНК-полимераза не может инициировать транскрипцию на ДНК, содержащей нуклеосомы [174].
Установлено также, что нуклеосомные коры и HI при размещении в промоторной области генов индивидуально репрессируют транскрипцию и по-разному взаимодействуют с факторами транскрипции, связывающимися со специфическими последовательностями [175]. Сборка нуклеосом на гене полностью блокирует его транскрипцию [176].
Гистонами, помимо репрессии транскрипции Р-РНК, Т-РНК и М-РНК, непосредственно ингибируется синтез самой ДНК [177]. Т.е. гистоны понижают еще и репликативную активность генома, а это при водит к известному возрастному снижению митотической активности клеток, что при больших количествах однотипных клеток в органах и тканях и сложности системы метаболизма каждой отдельной клетки проявляется в позднем онтогенезе как старение клеточных популяций в системе многоклеточного организма.
С другой стороны, существует сходство молекулярных событий во всех процессах онтогенеза и на всех уровнях становления организма, например, при развитии эмбриона и при дифференцировке эмбриональных стволовых клеток [178].
Итак, наиболее общий процесс онтогенеза, в том числе и его конечной стадии, состоит в том, что при старении происходит стремительная гетерохроматизация (инактивация) хромосом, что является ключевым фактором процесса старения при одновременном снижении уровня процессов репарации и увеличении частоты хромосомных аберраций, являющихся вторичными по отношению к гетерохроматизции [179]. В этом процессе метилирование ДНК и деацетилирование гистонов являются взаимодополняющими факторами, участвующими в изменении структуры определённого хромосомного локуса и приводящими соответственно к отсутствию экспрессии.
В связи с тем, что в генетическом аппарате не существует некой центральной управляющей структуры, ответственной за направленные процессы онтогенеза, а универсальность авторегуляции генной активности показана в таких, далеко отстоящих друг от друга элементах биосферы, как вирусы, бактерии, человек, и доказана практикой генной инженерии, то все это означает, что репрессия генома в клетках многоклеточного организма, которая происходит на всём протяжении онтогенеза - в эмбриогенезе, при созревании и старении организма, - вызвана не какой-то специальной генетической запрограммированностью онтогенеза, а обусловлена, в первую очередь, дозой генов неспецифических репрессоров- генов гистонов,... поскольку количество конечного продукта метаболизма зависит, как уже сказано, от числа копий данного гена.
См. также:
Введение
Биоорганизмы как большие системы
Введение в проблему старения многоклеточных организмов
Основной движительный фактор онтогенеза
Дифференциальная репрессия генетического аппарата в онтогенезе
Репрессия генома гистонами происходит на всем протяжении онтогенеза
Информационный и энтропийный аспект геронтогенеза
Не существует генов старения
К вопросу о теломерной (теломеразной) теории старения
Обсудить на форуме
