Тимербулатов В.М., Фаязов P.P., Тимербулатов Ш.В., Саяпов М.М., Саубанов М.Н., Сибиряк СВ.
(Башкирский государственный медицинский университет, г. Уфа e-mail: ufaendo@yandex.ru Институт иммунологии и фиизологии УрО РАН, г. Уфа-Екатеринбург)
Современные исследования в области клеточных технологий в хирургии позволяют рассматривать трансплантации, селезеночной ткани, как вариант восстановительной терапии стромальными стволовыми клетками. Подтверждением этому являются сообщения ряда исследователей о том, что для регуляции восстановительных процессов в поврежденных органах и тканях различного фенотипа возможно использовать селезеночную ткань, которой присуща не только иммуногенетическая, но и морфогенетическая функция [1,3,4]. Проведенные нами экспериментальные исследования позволили установить, что введение крысам с индуцированной панкреатэктомической и аллоксановой инсулиновой недостаточностью (ИН) аллогенных эмбриональных спленоцитов или аллогенных спленоцитов взрослых крыс, после предварительного культивирования клеток in vitro, обеспечивало коррекцию ИН, стабилизировало показатели гликемии, увеличивало выживаемость животных [2]. Представляло интерес выяснить некоторые фенотипические характеристики трансплантируемых клеток.
Кроме того, была поставлена задача: установить фенотипические особенности аутогенных спленоцитов, трансплантированных в брюшную полость крысы после спленэктомии, спустя 7 дней после проведенного оперативного вмешательства.
Культивирование клеток селезеночной ткани производилось после мягкого механического измельчения селезеночной ткани. Кусочки ткани трипсинизировали на магнитной мешалке (37°С, 3 мин). Клетки отмывали средой культивирования и затем культивировали в течение 7 суток в среде DMEM с добавлением 5% эмбриональной сыворотки («Биолот») в термальной комнате.
После культивирования осуществляли прямое двухпараметрическое окрашивание с использованием РЕ-меченых мышиных моноклональных антител против антигена CD45 крыс (анти CD45-PE, Caltag Labs) и FITC-меченых мышиных моноклональных антител против антигена CD90 крыс (анти CD90-FITC, Caltag Labs) и соответствующих «изотипических» контролей. Процедуру окрашивания осуществляли стандартным способом. Цитофлюорометрию осуществляли на проточном цитометре FACSCAlibur (BD). Данные анализировали в рамках программы CellQuest.
Для выяснения возможности выживания и фенотипических особенностей аутогенных спленоцитов реплантированных в брюшную полость крыс после спленэктомии, анестезированным крысам осуществляли спленэктомию, затем помещали в брюшную поллось 3-5 фрагментов селезеночной ткани, брюшную полость ушивали. Спустя 7 суток крыс забивали путем декапитации, извлекали фрагменты, измельчали их в стеклянном гомогенизациторе в растворе CellWash (BD) и осуществляли окрашивание и цитометрию. Таблица 1 и рисунок 1 иллюстрируют фенотипическую характеристику анализируемых клеток
Табл. 1. Фенотипическая характеристика эмбриональных спленоцитов и зрелых спленоцитов после 7-суточного культивирования и спленоцитов, полученных из реплантированных в брюшную полость фрагментов.
Известно, что стволовые клетки гематопоэтического происхождения экспрессируют на мембране как общелейкоцитарный антиген - гликопротеин CD45, так и, в отличие от зрелых клеток, антиген белок CD90 (Thy-1). На представленном слайде видно, что в культурах спленоцитов взрослых крыс количественно преобладали зрелые, CD45+CD90- клетки, доля стволовых гематопоэтических клеток (CD4S*ЂD90+) составила около 11%. В культурах эмбриональных спленоцитов количественно преобладали стволовые гематопоэтические клетки. Причем, несмотря на небольшое число наблюдений (n=3) в рамках однофакторного дисперсионного анализа были выявлены статистически значимые различия (F - критерий Фишера - 23.4, Р = 0.0084).
Рис.1 Цитофлюорограммы, иллюстрирующие результаты иммунофенотипирования эмбриональных и зрелых спленоцитов после 7-суточного культивирования и спленоцитов, полученных из имплантированных в брюшную полость фрагментов аутологичной селезенки (1 - аллогенные эмбриональные спленоциты, 2 - аллогенные спленоциты, 3 - аутологичные спленоциты из фрагментов селезенки).
Интересно, что в культурах эмбриональных спленоцитов идентифицировались клетки, которые экспрессировали антиген CD90, но не экспрессировали лейкоцитарный антиген CD45. Такой фенотип характерен для стромальных стволовых клеток [5]. Клеточная структура извлеченных из брюшной полости аутологичных фрагментов селезенки также характеризовалась как наличием зрелых форм гематопоэтических клеток, так и стволовых гематопоэтических и стромальных клеток.
Обнаружено, что селезенка может быть источником взрослых стволовых клеток, которые способны восстанавливать инсулин-продуцирующие участки поджелудочной железы [6]. Имеются исследования, указывающие на возможность синтеза инсулина стромальными клетками [7, 8]. Полученные в настоящей работе результаты убедительно подтверждают сохранность, и наличие стволовых гематопоэтических (и стромальных) клеток в составе трансплантируемых аллогенных спленоцитов после длительного культивирования. Кроме того, зрелые лейкоциты, гематопоэтические и стромальные стволовые клетки идентифицированы во аутологичных фрагментах селезенки реплантированных в брюшную полость после спленэктомии. Этот факт весьма интересен с точки зрения подходов к коррекции постспленэктомической недостаточности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Апарцин К.А. Хирургическая профилактика и способы коррекции послеоперационного гипоспленизма./Дисс. . док-pa мед. наук.- Иркутск, 2001.-293с.
2. Тимербулатов В.М., Фаязов P.P., Тимербулатов Ш.В., Саяпов М.М., Саубанов М.Н. Перспективы использования трансплантации селезеночной ткани при экспериментальной Исулинововй недостаточности // Вестн. Уральской академ. науки.-2006.-№ 1.-С. 113-116.
3. Тимербулатов В.М., Фаязов P.P., Хасанов А.Г., Тимербулатов М.В., Уразбахтин И.М. Хирургия абдоминальных повреждений. - М.: Из-во «МЕДпресс-информ», 2005.-255с.
4. Тимербулатов М. В., Хасанов А.Г., Фаязов P.P., Каюмов Ф.А. Органосохраняющая и миниинвазивная хирургия селезенки. - М.: Из-во «МЕДпресс - информ». - 2004. -218с.
5. Bieback К., Susanne Kern S., Kltiter H. et al. Critical Parameters for the Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Umbilical Cord Blood // Stem Cells -2004. - vol. 22. - P.625-634.
6. Kodama S., Faustman D.L. Routes to regenerating islet cells: stem cells and other biological therapies for type 1 diabetes // Pediatr Diabetes. - 2004. - Vol. 5. - P.38 - 44.
7. Shchegel'skaia E. et al. Pluripotency of bone marrow stromal cells and perspectives of their use in cell therapy//Ontogenez - 2003. - Vol.34. - P. 228 - 235.
Wong R. et al. Synthesis and release of human (pro)insulin in human BM progenitor cells// Cytotherapy - 2003. - Vol.5. - P. 273 - 275.
См. также:
Клеточные технологии в коррекции возрастных изменений кожи лица, лечении ран и трофических язв. Результаты клинических исследований
Сравнение цитофенотипических профилей клеток мезенхимального ряда, изолированных из различных тканей человека
Сравнение способности к дифференцировке в ткани мезодермы клеток мезенхимального ряда, изолированных из различных тканей человека
Экспериментальное исследование антиишемического эффекта препарата стволовых клеток пуповинной крови
Влияние стволовых клеток (СК) на течение инфаркта миокарда (ИМ) у свиней при интрамиокардиальном их введении (экспериментальное исследование на свиньях)
Исследование возможности репрограмирования мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, выделенных из жировой ткани человека, после пересадки их в энуклеированный ооцит
Бесцитокиновая активация gp130 на мобилизованных стволовых клетках крови (CD34+) ведет к их пролиферации и дифференцировке
Клиническое исследование стимуляция коллатерального кровообращения стволовыми клетками костного мозга
Стволовые клетки: проблемы правового регулирования
Эффективность и безопасность стентирования почечных артерий и трансплантации микста мобилизированных стволовых клеток периферической крови и жировой ткани в почечные и позвоночные артерии у больных реноваскулярной гипертензией атеросклеротического генеза длительностью более десяти лет
...
Обсудить на форуме
