Как уже обсуждалось в главе 2, повреждения ДНК накапливаются в клетках организма с возрастом (Bernstein, Bernstein, 1991; Vijg, 2000) и играют существенную роль в развитии многих патологических процессов, ассоциированных со старением, включая нейродегенеративные заболевания, атеросклероз и рак (Анисимов, Соловьев, 1999; Vijg, 2000). Вполне логичным выглядит предположение, что риск развития спонтанных опухолей будет большим у долгоживущих линий мышей по сравнению с таковой у короткоживущих линий. Однако не выявлено положительной корреляции между продолжительностью жизни и частотой появления опухолей, выявляемых у инбредных мышей различных линий (Storer, 1996; Smith et al., 1973; Анисимов, 1976; Anisimov, 1987). Частота развития спонтанных опухолей определяется скорее генетической спецификой и полом, чем продолжительностью жизни. Хорошо известно, что у некоторых долгоживущих и короткоживущих линий мышей частота спонтанных опухолей низкая, тогда как в других линиях мышей, характеризуемых различной продолжительностью жизни, частота появления спонтанных опухолей одинаково высока (от 80 до 100 %) (Staats, 1980; Anisimov, 1987). Показано, что имеет место высокая положительная корреляция между эффективностью репарации вызываемых канцерогеном бензо(а)пиреном повреждений в ДНК различных органов и продолжительностью жизни долгоживущих мышей линии C57BL/6 и короткоживущих мышей BALB/c (Boerrigter et al., 1995).
Pour и соавт. (1979) подчеркнули, что у хомячков генетические факторы более ответственны за вариабельность частоты появления спонтанных опухолей, их локализацию, гистологические типы, чем за продолжительность жизни этих животных. К аналогичному выводу i привел анализ вариабельности частоты возниновения спонтанных опухолей у крыс различных линий и разводок (Анисимов, 1976). В целом можно заключить, что положительная корреляция между частотой появления спонтанных опухолей и продолжительностью жизни животных разных линий отсутствует. Однако в последнем случае мы имеем дело с генетически различными животными. Следует отметить, что некоторые из них инфицированы онкогенными вирусами (например, вирусом MuMTV в мышах СЗН). Более важна корреляция между продолжительностью жизни и случаями спонтанных опухолей в различных группах (популяциях) животных одной линии или вида.
Наши наблюдения свидетельствуют о том, что более "прямоугольный" характер кривых выживания ассоциирован с увеличенной скоростью развития фатальных опухолей у крыс. В то же время увеличение в популяции животных доли слабых, уязвимых (frailty) особей в молодом возрасте приводит к уменьшению показателей смертности в старости и соответственно уменьшению скорости развития фатальных опухолей (Anisimov, 1987, 1998). К аналогичному выводу привел анализ результатов воздействия различных геропротекторов на кривые смертности мышей и крыс и кривые возникновения в этих же популяциях частоты новообразований (Anisimov, 1987, 1998, 2001) (см. главу 9).
Анализ имеющихся данных по транс генным и мутантным мышам свидетельствует о том, что только в некоторых моделях наблюдали увеличение продолжительности жизни животных. Мутантные карликовые мыши, нокаутные рбб-/- мыши, -MUPA и MGMT-трансгенные мыши живут дольше, чем соответствующие мыши дикого типа (Anisimov, 2001; Donehower, 2002). В большинстве случаев частота спонтанных опухолей у этих мышей была одинакова с таковой в контроле, тогда как латентный период развития опухолей был увеличен. Практически на всех моделях с ускоренным старением выявлено увеличение частоты развития опухолей и укорочение латентного периода (табл. 47).
Следует отметить, что этот феномен наблюдается как у мышей, которые имеют фенотип, более схожий с естественным старением, так и у мышей, имеющих только частичные признаки процесса старения. Почему это происходит?
Несомненно, старение способствует накоплению мутаций в соматических клетках, часть из которых существенна для инициации канцерогенеза в тканях-мишенях (Lengauer et al., 1998; Розенфельд, 2002). Полагают, что определенные типы повреждения ДНК и несоответствующие мутагенные сигналы могут быть причиной приобретения клетками старческого фенотипа (Campisi, 2001). Такой фенотип клетка может приобрести при воздействии множественных потенциально онкогенных стимулов. Эти данные позволили автору предположить, что клеточное старение - это надежный механизм самосохранения клеток от злокачественной трансформации. Несмотря на то что клеточное старение и другие защитные механизмы препятствуют канцерогенезу, возрастное увеличение частоты рака у млекопитающих практически неотвратимо (в отсутствие специальных воздействий).
Было описано увеличение накопления с возрастом хромосомных аберраций в печени короткоживущих мышей линии А по сравнению с долгоживущими мышами C57BL/6 (Crowley, Curtis, 1963). У короткоживущих мышей линий BDF1, SAMP6/Tan и A/J наблюдали быстрое увеличение с возрастом частоты обнаружения микроядрышек в ретикулоцитах, тогда как у долгоживущих мышей линий ddY, CD-1, B6C3F1, SAMR1 и MS/Ae возрастное увеличение частоты спонтанных микроядрышек было не столь выражено (Sato et al., 1995). Долгоживущие мутантные карликовые мыши Эймса и нокаутные р66shc-/- мыши были более резистентны к окислительным повреждениям ДНК, чем мыши дикого типа (Migliaccio et al., 1999), тогда как у мышей линии SAMP с ускоренным старением наблюдается увеличение генерации АКФ кислорода (Takeda, 1999), увеличение частоты повреждений ДНК и соматических мутаций по сравнению с линией SAMR, устойчивой к старению (Hosokawa et al., 2000). Трансгенные мыши с избыточной экспрессией гена MGMT более устойчивы к алкилирующим агентам (Walter et al.,1997), тогда как мыши с дефицитом этого гена или нокаутные по гену Parp-/- более чувствительны к воздействию алкилирующих канцерогенов и ионизирующей радиации (Glassner et al., 1999; Masutani et al., 2000). He было обнаружено значительных отличий в мутационном спектре и частоте мутаций между мышами р5З-/- и р53+/+ (Buettner et al., 1997), в то время как частота спонтанных опухолей у нокаутных р5З-/- мышей была существенно большей, чем у мышей дикого типа (Hursting et al., 1995; Jacks et al., 1997; Atardi et al., 1997). Дефицитные по гену щелевых контактов мыши Cx32-/- имеют исключительно высокую чувствительность к спонтанному и химически индуцированному канцерогенезу (Temme et al., 1997). Мыши с дефектом гена пигментной ксеродермы группы А (ХРА) со сниженной эксцизионной репарацией нуклеотидов имеют более чем в 1000 раз увеличенный риск развития индуцируемого ультрафиолетовым облучением рака кожи, а также увеличенную чувствительность внутренних органон к мутагенезу и развитию рака после воздействия химическими канцерогенами (Van Steeg et al., 1998, 2000). Однако частота спонтанных опухолей у этих мышей была сравнительно низкой - только 15 %, и развивались опухоли только в возрасте старше 18 месяцев (Van Steeg et al., 1998). Важно отметить, что скорость накопления с возрастом соматических мутаций значительно варьирует в различных тканях мышей (Vijg, 2000). Известно довольно большое число доброкачественных или высокодифференцированных и отвечающих на регулирующие сигналы опухолей, в которых выявляют много потенциально онкогенных мутаций, что позволяет предположить, что тканевое микроокружение может подавлять экспрессию многих злокачественных фенотипов (Campisi, 2001; DePinho, 2000). Полагают, что репликативное клеточное старение играет определенную роль в старении всего организма. Стареющие клетки с нарушенной функцией накапливаются в тканях с возрастом и повреждают микроокружение (Campisi, 2001). Таким образом, накопление мутаций вместе с накоплением репликативно старых клеток, по мнению этих авторов, приводит к увеличению риска развития рака, что является существенной характеристикой процесса старения млекопитающих. Однако, обсуждая различия в биологии теломеры у человека и мыши, W. E. Wright и J. W. Shay (2000) предположили, что в отличие от клеток человека мышиные клетки не подвергаются репликативному старению.
В соответствии с многостадийной, моделью канцерогенеза число клеток, подвергшихся частичной трансформации, должно увеличиваться с возрастом. Доказательства в пользу такой точки зрения были суммированы нами ранее (Anisimov, 1998). Предполагалось, что большинство генов, определяющих развитие злокачественных опухолей, является генами, контролирующими клеточную пролиферацию и гибель клеток непосредственно, действуя как своеобразные "сторожа" ("gatekeepers"). В последние годы стало понятно, что гены, которые поддерживают интеграцию и стабильность генома (гены репарации ДНК) и являются "смотрителями" ("caretakers"), возможно, даже чаще приводят к возникновению рака, Гены-"сторожа" прямо регулируют рост опухолей, обычно подавляя его. Инактивация этих генов определяет тканеспецифическое распределение рака. Наоборот, инак-тинация генов-"смотрителей" приводит к нестабильности генома, в результате чего увеличивается частота мутации всех генов, включая гены-"сторожа" (Kinzler, Vogelstein, 1997). Однако, несмотря на всю привлекательность этой классификации, она представляется сверхупрощением реальной ситуации. Например, дефект гена репарации ДНК MSH2 приводит к развитию лишь очень небольшой части рака толстой кишки и не имеет места в других типах рака человека. В то же время нарушения функции генов р53 и Rb наблюдаются в 80- 90 % всех случаев рака. Важную роль в промоции и прогрессии опухолей играют гены, участвующие в метаболизме и росте тканей, и гены иммунной передачи сигналов, такие как GH, IGF-1, APO E, TCR и др. Это гены, действующие как "гомеостатические". Имеющиеся данные показывают, что все типы генов включены в контроль как опухолевого роста, так и старения (рис. 20).
Мыши с выключенным геном теломеразы предоставляют возможность понять значение существенного укорочения теломер для всего организма. Выживаемость таких мышей (mTR-/-) драматически уменьшается с нозрастом, и у них высока частота злокачественных новообразований (главным образом лимфом и тератокарцином) по сравнению с диким типом (Rudolph et al., 1999). Имеются указания, что выраженный иммунодефицит ответствен за плохое состояние здоровья и гибель этих мышей (Blasco, 2002). Эксперименты с мышами с выключенной теломеразой показывают, что связанный с теломерои и регулируемый р53 кризис способствует канцерогенезу, стимулируя нестабильность хромосом (Artandi, DePinho, 2000). Различия в длине теломер и их регуляции могут оказывать существенное влияние на спектр и цитогенетическую характеристику возникающих опухолей при старении (Artandi et al., 2000). Трансфекция теломеразы мышам поздних поколений с выключенной теломеразой (Теrt-/-), у которых укорочены теломеры и имеют место выраженные пролиферативные патологические процессы, восстанавливая у них теломеразную активность, позволяет им избежать хромосомной нестабильности и преждевременного старения (Samper et al.t 2001). Для оценки возможного риска экспрессии теломеразы в соматических клетках взрослых животных были сконструированы трансгенные мыши K5-Tert (Gonzalez-Suarez et al., 2002). У этих мышей наблюдалась суперэкспрессия теломеразы в многослойных эпителиях, у них быстро заживали раны и была увеличена частота развития спонтанных и индуцируемых канцерогенами опухолей.
Очевидно, что старение и канцерогенез представляют собой сложные многостадийные процессы, которые могут зависеть от многих причин. В этом смысле новые трансгенные и нокаутные мышиные модели с увеличенной или укороченной продолжительностью жизни являются важным инструментом для оценки роли генов, включенных в старение, в механизме канцерогенеза и других патологических процессов, связанных с возрастом.
Необходимо отметить, что использование трансгенных животных в изучении старения имеет еще очень непродолжительную историю, и публикуемые работы часто весьма уязвимы с точки зрения адекватности экспериментального протокола решению поставленных задач. Довольно часто число животных в экспериментальной и контрольной группах в исследованиях роли суперэкспрессии или подавления отдельных генов на продолжительность жизни очень мало для корректного суждения о характере взаимосвязи между скоростью старения и развитием патологии у генетически модифицированных животных и животных дикого типа. Как правило, в таких опытах изучаются только единичные биомаркеры старения. Иногда трудно оценить модель как действительное ускорение нормального старения или как синдром прогерии. В отчетах о больших и весьма трудоемких исследованиях зачастую не приводятся сведения о причинах смерти животных, и частоте спонтанных опухолей. Недавно была обсуждена программа по адекватной оценке методов вмешательства с целью увеличения продолжительности здоровой жизни (Warner et al., 2000). Вместе с тем хорошо известны стандартные протоколы долговременных и краткосрочных испытаний для оценки канцерогенного риска химических веществ и других воздействий в экспериментах на грызунах и других животных (Montesano et al., 1986). Представляется целесообразным использование подобных подходов при изучении старения и возрастной патологии у трансгенных мышей. Не менее важно включение геронтологических исследований в протоколы систематического изучения трансгенных животных. Обычно опыты по канцерогенезу длятся довольно долго. Однако онкологи обычно не уделяют внимания процессам старения у таких животных. Унификация подходов к изучению трансгенных животных будет способствовать существенному расширению наших знаний о природе старения и рака.
См. также:
6.1. Введение
6.2. Методы получения трансгенных мышей
6.3. Выбор линии мышей для получения трансгенных животных
6.4. Генетические модификации, ускоряющие старение у мышей
6.5. Генетические модификации, замедляющие старение у мышей
Обсудить на форуме
