Около 100 лет тому назад в связи с развитием методов поддержания клеток in vitro со всей остротой встал вопрос о том, ограничен ли потенциал клеток многоклеточного организма. Классическими стали опыты А. Карреля (рис. 7), который культивировал фибробласты сердца куриных эмбрионов в культуре в течение 34 лет, при этом клетки прошли тысячи делений без изменений их морфологического строения или скорости роста. Эти опыты встретили серьезные возражения. В частности, указывалось, что несовершенство методов культивирования приводило к внесению свежих клеток в культуры при каждом их пересеве. Подробный анализ результатов работ А. Карреля дал А. Н. Хохлов (1988), который пришел к выводу, что эти результаты были артефактом, и вместе с тем отметил безусловный вклад А. Карреля в возникновение цитогеронтологии как самостоятельного научного направления. С другой стороны, онкологам хорошо известны многочисленные штаммы перевиваемых in vivo и in vitro опухолевых штаммов и линий, которые поддерживаются в течение многих, иногда десятков лет, то есть их клетки являются практически бессмертными (иммортализированными). Наряду с этими опытами появились наблюдения, что в клеточных, культурах все же не удается длительно поддерживать клетки, полученные из нормальных, не опухолевых тканей.
В 1961 г. Hayflick и Moorhead представили данные о том, что даже в идеальных условиях культивирования фибробласты эмбриона человека способны делиться только ограниченное число раз (50 ± 10). Было установлено, что при самом тщательном соблюдении всех мер предосторожности при пересевах клетки проходят in vitro ряд вполне морфологически различимых стадий (фаз), после чего их способность к пролиферации исчерпывается, и в таком состоянии клетки способны находиться длительное время. В повторных опытах это наблюдение было многократно воспроизведено, последняя фаза жизни клеток в культуре была уподоблена клеточному старению, а сам феномен получил по имени автора название "предела Хейфлика". Более того, оказалось, что с увеличением возраста донора число делений, которые были способны совершить клетки организма, существенно уменьшалось, что привело к представлению о существовании гипотетического счетчика делений, ограничивающего общее их число (Hayflick, 1998).
В настоящее время принято считать, что в отличие от половых и стволовых клеток большинство типов соматических клеток имеет ограниченный пролиферативный потенциал in vitro. Наряду с фибробластами этот феномен показан для глиальных клеток, кератиноцитов, гладких мышц сосудистой стенки, клеток хрусталика, эндотелиальных клеток и лимфоцитов. После ограниченного числа клеточных делений (50-70 для эмбриональных фибробластов человека) нормальные соматические клетки человека переходят в нерепликативное состояние, называемое клеточным старением (senescence), или стадией смертности 1 (M1) (Hayflick, 1998; Wei, Sedivy, 1999). В таких клетках активирована -галактозидаза, которая не обнаруживается в покоящихся или терминально дифференцированных клетках и рассматривается как маркер клеточного старения (Dimri et al., 1995; Yegorov et al., 1998). Однако некоторым авторам удалось наблюдать экспрессию -галактозидазы в клетках, находящихся в фазе покоя (G0), и связанную скорее с лизосомальным повреждением, а не со старением (Severino et al., 2000). Установлено, что трансфекция белком большого Т антигена SV40, аденовирусом E1A и белком Е1В, или белком вируса папилломы HPV E6/E7, вмешивающихся в регуляторное действие антионкогенов р53 и Rb, существенно увеличивает продолжительность жизни клеток in vitro (Shay et al., 1991).
В табл. 17 приведены основные характеристики старых клеток in vitro.
В конце фазы увеличенной продолжительности жизни наступает другая стадия уменьшения репликативной способности клеток, называемая кризисом или стадией смертности 2 (М2). При этом небольшая, но существенная фракция клеток, находящихся в фазе М2, может подвергаться иммортализации. Полагают, что, хотя уменьшение пролиферативного потенциала при клеточном старении первично вызывается уменьшением способности к клеточным делениям, при кризисе уменьшение пролиферации вызывается увеличением клеточной гибели, что является фактором регуляции клеточного гомеостаза (Wei, Sedivy, 1998).
Установлено, что при серийных трансплантациях некоторых нормальных соматических тканей, таких как кожа или молочная железа, от старых доноров молодым сингенным мышам имеет место постепенное снижение пролиферативной активности в пересаживаемой ткани (Harrison et al., 1978).
Соответствуют ли изменения, наблюдаемые в клетках in vitro, изменениям, происходящим при естественном старении in vitro. Показано, что число удвоений клеток в культуре обратно коррелирует с видовой продолжительностью жизни в ряду позвоночных (Rohme, 1981). Между возрастом донора и репликативной продолжительностью жизни in vitro имеет место отрицательная зависимость (Hayflick, 1998). Эту зависимость наблюдали при изучении клеток нескольких типов, включая гепатоциты, кератиноциты, гладкомышечные клетки артерий. Вместе с тем было установлено, что если тщательно производить биопсию и отбирать только здоровых доноров, то корреляцию между клеточным старением фибробластов человека в культуре и возрастом доноров обнаружить не удается (Cristofalo et al., 1998). Клеточные культуры, полученные от доноров, страдающих различными заболеваниями, такими как сахарный диабет, синдромы Вернера (прогерия взрослых) и Дауна, также характеризуются уменьшенным пролиферативным потенциалом (Hayflick, 1998). Однако при синдроме Хатчинсона-Гилфорда (прогерия детей) такого уменьшения не наблюдали (Brown, 1990).
Следует отметить, что клеточное старение является необязательным последствием пролиферации в культуре. Так, шванновские клетки обладают неограниченным потенциалом к удвоению in vitro, тогда как фибробласты, выделенные из тех же нервов, подвергаются классическому репликативному старению, наблюдаемому в фибробластах грызунов (Mathon et al., 2001). Эндотелиальные клетки пупочной вены человека останавливаются в G1 фазе клеточного цикла, но в отличие от фибробластов подвергаются зависимой от возраста тетраплоидизации и апоптотической клеточной гибели, тем самым существенно отличаясь от резистентных к апоптозу старых фибробластов (Wagner et ai., 2001). Некоторые другие клетки-предшественики грызунов (например, олигодендроциты) также имеют неограниченный пролиферативный потенциал, когда в культуре поддерживаются условия, устраняющие как дифференцировку, так и блокаду клеточного цикла (Tang et al., 2001). С другой стороны, пролиферативный потенциал некоторых эпителиальных тканей (кожа, хрусталик, пигментный эпителий сетчатки, кора надпочечников), а также неэпителиальных тканей (клетки гладкой мускулатуры, остеобласты и хондроциты) существенно уменьшается с возрастом (Hornsby, 2002). Другим примером являются эндотелиальные клетки и миобласты. Длина теломер в клетках эндотелия уменьшается с возрастом. Большее укорочение теломер наблюдается в клетках с большей пролиферативной активностью in vivo.
См. также:
3.2. Роль теломер и теломеразы в старении
3.3. Апоптоз и продолжительность жизни
3.4. Взаимоотношения клеточного старения и апоптоза
Обсудить на форуме
