Изучение влияния температуры на ПЖ холоднокровных доказало большие возможности увеличения ПЖ с помощью температурных факторов и одновременно стало ареной оживленной дискуссии и экспериментальной проверки многих гипотез старения. Так, большим вкладом Леба и Нортропа (Loeb, Northrop, 1917) является не только показанная ими возможность увеличения всех периодов онтогенеза дрозофил (личиночной, куколочной и имагинальной) простым снижением температуры инкубации, но и впервые проведенный ими расчет энергии активации процессов, определяющих ПЖ. Дело в том, что различные по природе процессы, как оказалось, имеют разные диапазоны энергии активации. Для подавляющего большинства физических процессов (типа диффузии и др.) характерны энергии активации до 30 кДж/моль, ферментативных - 30-50, химических - 80-120, а процессов типа денатурации макромолекул - 200 кДж/моль и более (Тарусов и др., 1968). Таким образом, зная ПЖ хотя бы при двух разных температурах, можно рассчитать энергию активации и предсказать природу факторов, определяющих ПЖ. Строго говоря, для такого «многоканального» процесса, как старение, определение энергии активации не позволяет однозначно установить природу звена, лимитирующего ПЖ. Например, при определенных соотношениях физических и денатурационных процессов энергия активации может соответствовать ферментативным процессам. Однако не следует переоценивать вероятность подобных искажений. Недостаточная строгость оценок энергии активации не лишает их определенного смысла, и, в частности, ими достаточно широко пользуются для предсказания природы факторов, детерминирующих ПЖ. Полученная Лебом и Нортропом величина (примерно 80 кДж/моль) позволила им выдвинуть «химическую гипотезу» старения, согласно которой «ПЖ определяется образованием субстанции (субстанций), приводящей к старости и естественной смерти, или деструкцией субстанции (субстанций), которая в норме препятствует старению и естественной смерти» (Loeb, Northrop, 1917). В попытках последующей конкретизации природы подобных «субстанций» неоднократно обсуждалась роль свободных радикалов, спонтанной депуринизации и депиримидинизации ДНК, неферментативного дезамидирования белков, рацимизации различных остатков макромолекул типа нуклеиновых кислот и белков и др., так что, строго говоря, основанные на этих сдвигах гипотезы старения следует рассматривать как частные следствия, исходящие из «химической гипотезы» Леба и Нортропа.
В 20-30-е годы возможность увеличения ПЖ дрозофил по мере снижения температуры инкубации была подтверждена рядом авторов, в частности Перлом (Pearl, 1928), который обратил внимание на то, что при высоких температурах растет активность мух, увеличивается их газообмен и др. Эти наблюдения легли в основу выдвинутой им гипотезы «уровня жизни», согласно которой при высоких температурах мухи живут меньше попросту потому, что у них выше «уровень жизни». Нетрудно заметить, что эта гипотеза по существу представляет собой более «расплывчат^ю» интерпретацию идеи «изнашивания», тем не менее, очевидно, из-за своей простоты именно она до сих пор пользуется наибольшей популярностью при объяснении результатов опытов по продлению жизни на холоднокровных моделях.
Проведя более подробный анализ кривых смертности дрозофил, инкубированных при разных температурах, Смит (Smith, 1958) пришел к заключению, что у холоднокровных следует различать два этапа - старение (индукция) и вымирание (развитие). Первый из них не зависит от температуры, и только после достижения некоего «порогового уровня старения» начинается этап вымирания, который уже зависит от температуры.
Подобное представление разрывает ту биологическую причинно-следственную связь, которая существует между старением и ПЖ.
Но какими бы ни были предполагаемые механизмы действия температурных факторов, важно то, что в определенном диапазоне температур, как правило, включающим оптимум для размножения и жизнедеятельности, по мере снижения температуры окружающей среды ПЖ холоднокровных прогрессивно растет.
Таблица 14
Влияние температуры инкубации на СПЖ (сут) холоднокровных
Пределы подобного роста ПЖ (иногда в десятки раз) настолько широки, а сам феномен показан для такого большого числа биологических объектов (от культур клеток до холоднокровных позвоночных), что важная роль температурных факторов в определении ПЖ холоднокровных не может вызвать сомнений. В справедливости этого утверждения, с нашей точки зрения, легко убедиться после анализа данных табл. 14. В более чем 60 сериях опытов, проведенных разными авторами и на разных объектах, снижение температуры инкубации неизменно приводило к увеличению ПЖ. Более того, ни одно из известных к настоящему времени воздействий не только по простоте, но и по эффекту пролонгирования не может быть сопоставлено с температурами, что делает его одной из наиболее многообещающих моделей для изучения старения и путей продления жизни.
Для объяснения влияния температуры на ПЖ холоднокровных был предложен и ряд других гипотез, в которых делается попытка комбинировать отдельные положения вышеуказанных гипотез или объяснить имеющийся экспериментальный материал с других позиций. Так, известна гипотеза рацимизации, согласно которой первопричиной старения является превращение L-аминокислотных остатков белков в D-аминокислотные. Так как скорость спонтанной рацимизации практически не зависит ни от химического окружения (рН и др.), ни от влияния внешних факторов и почти целиком определяется температурой, то ряд авторов полагает, что температурной зависимостью скорости рацимизации можно объяснить увеличение ПЖ холоднокровных при снижении температуры инкубации (DeLong, Poplin, 1977). Однако учитывая, что период полужизни даже наиболее быстро рацимизирующихся аминокислот, например аспартатовой кислоты, составляет 3500 лет, фенилаланина - 2000 лет при 25 0C, вряд ли можно всерьез обсуждать роль этих процессов при объяснении ПЖ большинства изученных холоднокровных, измеряемых сутками и месяцами. При экстраполяции к 37 0C период полурацимизации аспартата (490 лет) или фенилаланина (302 года) становится соизмеримым с периодом полужизни наиболее долгоживущих макромолекул и, по всей вероятности, может играть определенную роль в старении. У 60-70-летнего человека примерно 10 % аспартата и 15 % фенилаланина белков эмали состоит из D-изомеров. Но, как отмечает, например, Ламб (Lamb, 1980), ни одна из этих гипотез не в состоянии удовлетворительно объяснить весь имеющийся экспериментальный материал. Одни данные хорошо согласуются с предсказаниями гипотезы «уровня жизни», другие - «порогов старения» и т. д. Причины подобных расхождений экспериментальных данных и теоретических предсказаний, на наш взгляд, заключаются в общем для указанных выше гипотез недостатке - переоценке роли повреждающих факторов и почти полном игнорировании роли восстанавливающих факторов, процессов витаукта. Ведь клетки и организм в целом обладают во многих отношениях совершенными защитными системами, которые с разной степенью успеха, но постоянно противодействуют влиянию повреждающих факторов. Иначе говоря, ПЖ определяется не столько уровнем повреждающих факторов, на которые делается основной акцент в «химической» и многочисленных родственных с ней гипотезах старения, сколько соотношением влияния повреждающих и восстанавливающих факторов, процессов старения и витаукта. Учитывая, что по своей природе первые в основном стохастические и химические, а вторые ферментативные, можно утверждать, что ПЖ в конечном итоге определяется соотношением факторов ферментативной и химической природы.
С позиций подобной химико-ферментативной гипотезы старения легко объяснить рост ПЖ по мере снижения температуры инкубации. Поскольку из-за более высокой энергии активации скорость химических реакций при снижении температуры должна снижаться в большей степени, чем ферментативных, то по мере снижения температуры соотношение скоростей процессов старения и витаукта должно изменяться в пользу последних, что и может обеспечить большую ПЖ. Например, при снижении температуры на каждые 100C скорость «типичных» химических процессов должна снижаться почти в 1.5 раза быстрее, чем ферментативных. Исходя из химико-ферментативной гипотезы, следует допустить, что до определенного диапазона «равновесных» температур определяющими для ПЖ должны быть ферментативные процессы, а выше - химические. Это предположение в целом соответствует результатам анализа рассчитанных нами данных по энергии активации и Qi0, приведенных в табл. 14.
Рис. 37. Гистограмма распределения энерт ии активации (кДж/моль) процессов старения у холоднокровных.
/ - до 30 (физические), 2 - 30-50 (ферментативные), 3 - 50-80 (промежуточные между ферментативными и химическими), 4 - 80-120 (химические), 5 - более 120 (химические с высокой энергией активации).
Как видно из гистограмм рис. 37, по энергии активации результаты имеющихся работ почти равномерно распределяются между ферментативными, химическими и промежуточными процессами.
Совершенно очевидно, что 10У подобные соотношения между скоростями процессов старения и витаукта сохраняются лишь в определенном диапазоне температур, обычно соответствующем естественным условиям 1 z 3 * 5 существования. При более низких или высоких температурах ПЖ может зависеть от влияния факторов биологической или небиологической природы, нередко вовсе не связанных с процессом старения. Например, при температурах ниже оптимальной дрозофилы становятся настолько физически малоактивны, что, очевидно, теряют способность питаться и выполнять другие необходимые для нормальной жизнедеятельности функции. Чем больше отклонение температуры от нижней границы оптимального диапазона, тем сильнее и на более ранних этапах онтогенеза сказывается влияние этих факторов, тем выраженное сокращение ПЖ. Так, в наших опытах СПЖ и МПЖ увеличивались по мере снижения температуры вплоть до 15 0C, достигая при этом 155 и 213 сут соответственно. Однако при 10 0C СПЖ и МПЖ несколько снижались (136 и 204 сут соответственно), а при 5 0C и ниже ПЖ мухи превышала несколько недель или суток.
Особый интерес представлял характер изменения ПЖ холоднокровных при температурах, близких к температуре тела теплокровных организмов. Оказалось, что для большинства изученных видов увеличение температуры выше 30 0C приводит к резкому сокращению ПЖ. Судя по величинам энергии активации, при этом определяющими ПЖ становятся процессы типа денатурации или деградации макромолекул. Так, по оценке на Drosophila subobscura энергия активации процессов, определяющих сроки жизни, в диапазоне 3-28 0C составляла 93.8 кДж/моль, а при 28-40 0C увеличивалась почти на порядок - 761 кДж/моль (HoIlingsworth, 1969). Аналогичные величины в проведенных нами исследованиях составляли для диапазона 15 -30 0C 73 4кДж/моль, а при 30-37.5 0C - 685 кДж/моль. На основании Этих данных можно заключить, что ПЖ холоднокровных в диапазоне оптимальных температур определяется процессами ферментативной и химической природы, а при более высоких температурах - денатурацией и деградацией макромолекул. До определенного предела подобные денатурационные повреждения, очевидно, практически полностью обратимы. По крайней мере об этом свидетельствуют результаты опытов, проведенных Стрелером (Strehler, 1961): мух в течение 1 ч держали при температуре 36-38 0C, что приводило к гибели до 95 % мух. Однако выжившие особи, перенесенные в 25 0C, существенно не отличались по ПЖ от интактных. На основании этих данных Стрелер заключает, что причиной старения мух при оптимальных температурах, очевидно, не являются процессы денатурации макромолекул, так как резкое ускорение этих процессов при кратковременном увеличении температуры не приводит к суммированию эффектов старения и влияния высокой температуры. По мнению Стрелера, увеличение ПЖ холоднокровных при снижении температуры окружающей среды может быть обусловлено как падением скорости всех биологических процессов, так и эволюционно приобретенным признаком, позволяющим пережить периоды с низкой температурой, обычно сопровождаемые уменьшением доступности источников питания. Важно подчеркнуть, что при снижении температуры растет ПЖ не только многоклеточных организмов, но и одноклеточных, культур клеток растительного и животного происхождения, в том числе клеток, полученных из тканей человека (Шарий и др., 1978). Результаты этих опытов свидетельствуют, что увеличение ПЖ по мере снижения температуры, очевидно, опосредовано сдвигами на субклеточном уровне. Например, при низких температурах, помимо существенных изменений интенсивности метаболизма, транскрипции и трансляции, наблюдаются изменения укладки нуклеопротеинового комплекса ядра, количества копий гистоновых генов, доли сателлитной ДНК и т. д. (Чернышев и др., 1979). Более того, есть основания полагать, что ПЖ во многом определяется термодинамическими характеристиками биологических макромолекул. Так, согласно термодинамической гипотезе регуляции кругооборота белка в клетке существует положительная коррелятивная связь между периодом полужизни белков и их температурной стабильностью. Это было экспериментально показано для подавляющего большинства изученных белковферментов - альдолозы,фруктозо-1,6-дифосфатазы, малат-, ЛДГ, аргиназы, фосфофруктокиназы, РНКазы, пируваткиназы, ксантооксидазы и др. Из всех изученных белков только 3-фосфатдегидрогеназа составляла исключение из этого правила - стабильная к протеолизу, она оказалась термодинамически малоустойчивой (McLendon, Radany, 1978). Известно, что для сохранения высокой каталитической активности, способности связывать субстраты и различные регуляторные соединения от молекулы фермента требуется определенная гибкость структуры, позволяющая с наименьшими энергетическими затратами принимать необходимую конформацию. С другой стороны, белковая молекула должна обладать достаточной жесткостью для сохранения целостности вторичной и третичной структуры. В определенном диапазоне подобные противоречивые требования удовлетворительно решаются структурным «компромиссом», благодаря чему достигается оптимальный баланс между, эффективностью и чувствительностью к регуляции, с одной стороны, и устойчивостью или продолжительностью безотказного функционирования - с другой (Somero, 1978). При выходе уровня повреждающих факторов за пределы этого диапазона, например при увеличении температуры инкубации, проблема может быть решена заменой «структурно слабых» ферментов изоферментами с большей устойчивостью. Так, по степени убывания термостабильности пять изоферментов ЛДГ митохондрий печени серебряного карася располагаются в ряду ЛДГ-1, ЛДГ-2, ЛДГ-3, ЛДГ-4 и ЛДГ-5. При акклиматизации рыб к высокой температуре наблюдается постепенная замена ЛДГ-4 и ЛДГ-5 на ЛДГ-1, ЛДГ-2 и ЛДГ-3 (Yamawaki, Tsukuda, 1979). Возможно, благодаря наличию подобных «гибких» механизмов селекция внутри линий изосамок дрозофил уже через 10 поколений дает существенные различия по повышенной или пониженной теплоустойчивости (Morrison, Milkman, 1978). Аналогичные данные были получены авторами, работавшими как с другими линиями дрозофил, так и с другими видами холоднокровных (Cohet, 1975; Soliman, Lints, 1982).
Несколько неожиданные результаты были получены в опытах, в которых пойкилотермных животных инкубировали не при постоянной, а при переменных температурах. Оказалось, что ПЖ была выше, чем при инкубации при постоянной температуре, соответствующей среднему значению переменной температуры. Эта закономерность сохранялась как при инкубации имаго при постоянно изменяющейся по синусоидальному закону, так и при периодической пересадке с одной температуры в другую (Halbach, 1973; Soliman, Lints, 1982). Еще более неожиданными оказались результаты опытов с реципрокной пересадкой южноамериканских рыб Cynolebias bellottii с 15 в 20 0C, и наоборот. Рыбы, которые провели первую половину жизни при низкой температуре, а вторую при высокой, как и следовало ожидать, имели ПЖ, промежуточную между аналогичными показателями рыб, проживших при постоянной температуре 15 или 20 0C. Однако при пересадке с высокой температуры в низкую ПЖ не только не уступала, но и несколько превышала аналогичный показатель рыб, проживших при низкой температуре (Liu, Walford, 1975). Ясно, что ни «химическая», ни гипотезы «уровня жизни» или «порогов старения» не в состоянии сколько-нибудь удовлетворительно объяснить подобные данные. Исходя же из наших представлений, «сверхдолголетие» при пересадках с высокой температуры в низкую можно объяснить хорошо известным фактом акклимационного эффекта ферментативных систем холоднокровных животных. При пересадке с высокой температуры в низкую скорость повреждающих химических процессов снижается практически одновременно со снижением температуры, тогда как активность многих ферментативных систем продолжает оставаться на уровне более высоком, чем соответствующий низкой температуре (Ивлева, 1972). Благодаря более высокому соотношению скоростей ферментативных и химических реакций, процессов витаукта и старения может быть достигнут значительный рост ПЖ холоднокровных организмов при пересадке с высокой в низкие температуры.
Выше указывалось, что ни одна из известных к настоящему времени моделей не позволяет столь просто, и главное в столь широких пределах изменять ПЖ, как инкубации при разных температурах. Простота и однозначность реакции делает холоднокровных уникальной моделью «управляемого» старения, изменяет психологию исследователя, позволяя с позиций пассивного наблюдателя, как это имеет место при испытании других геропротекторов, перейти в активную позицию, контролируя и целенаправленно управляя темпом старения. С этой точки зрения холоднокровные животные являются незаменимыми объектами для изучения качественной и количественной стороны связи отдельных биологических показателей с ПЖ. Среди подобных показателей особо важное значение придается структурно-функциональным характеристикам генетического аппарата. Однако до сих пор эта задача не решена даже для таких важных показателей, как интенсивность биосинтеза РНК и белка, посттрансляционных модификаций и др. Для решения этих и ряда других вопросов нами совместно с A. H. Тимченко было изучено влияние температуры инкубации у дрозофил при 11 разных температурах в диапазоне 10-40 0C. В этих сериях опытов, полученных от одной и той же линейной родительской популяции, имаго в возрасте 1-3 сут переносили в термостаты с разными температурами, тем самым предполагая примерную генетическую однородность «исходного материала».
Нами была обнаружена отчетливая обратная зависимость между ПЖ и температурой инкубации имаго дрозофил вплоть до 15 0C. При более низких температурах (100C и ниже) СПЖ и МПЖ начинали снижаться (рис. 38). В координатах уравнения Гомперца смертность описывается прямыми, угол наклона которых постепенно растет по мере увеличения температуры инкубации. При этом уязвимость, оцениваемая величиной Ro, была минимальна при температурах выше температуры инкубации на личиночном и куколочном этапах (27.5-32.5 0C). Эта величина постепенно снижалась и по мере падения температуры инкубации имаго (рис. 39). В диапазоне 15-32.5 0C расчетные величины энергии активации указывали на химическую или ферментативную природу факторов, определяющих ПЖ. При более высоких температурах величина энергии активации скачкообразно увеличивалась до 1 МДж/моль и более, указывая на денатурационную и деградационную природу факторов, определяющих ПЖ.
Рис. 38. Регрессионные прямые смертности дрозофил линии D-18, инкубированных при разных температурах (0C) 1 - 10, 2 - 15, 3 - 20, 4 - 22 5, 5 - 25, 6 - 27 5, 7 - 30, 8 - 32 5.
Из графиков, представленных на рис. 39, видно, что температурная зависимость энергии активации (E) и возрастного роста смертности (а) имеет одинаковую направленность, с той лишь разницей, что сдвиги а примерно на 5 0C опережают сдвиги энергии активации. В диапазоне 15-350C эти зависимости имели вид:
Данные о влиянии температуры инкубации на интенсивность биосинтеза РНК и белка, а также выделения углекислого газа приведены на рис. 40. Из этих графиков видно, что до 30 0C повышение температуры приводит к росту интенсивности биосинтетических и метаболических процессов. Однако при более высоких температурах ОУР белка и РНК резко падают, а количество выделяемого СОг продолжает расти. Подобное несоответствие между интенсивностью метаболических процессов и их пластической обеспеченностью, возможно, и является причиной резкого снижения СПЖ и МПЖ при высоких температурах. В оптимальном диапазоне температур между интенсивностью биосинтетических или метаболических процессов и температурой (/, 0C) существуют зависимости:
Рис. 39. СПЖ и МПЖ [A), энергия активации (Б) и коэффициент а у дрозофил, инкубированных при разных температурах.
Из этих уравнений видно, что по мере увеличения температуры инкубации интенсивность транскрипционных процессов растет несколько быстрее, чем метаболических или трансляционных. Однако расчет соответствующих частных коэффициентов корреляции показывает, что ближе всего к причинно-следственной корреляции связь между температурой и биосинтезом белка.
В целом, сравнивая кривые на рис 39 и 40, можно заключить, что в диапазоне оптимальных температур существует отрицательная коррелятивная зависимость между ПЖ и интенсивностью биосинтетических или метаболических процессов.
Рис. 40. Интенсивность биосинтеза ОУР РНК (/) и белка (2), количество выде ляемого углекислого газа (3) у дрозофил линии D-18, инкубированных при разных температурах.
За пределами этого диапазона коррелятивная зависимость положительная
В диапазоне оптимальных температур между ПЖ и интенсивностью обменных процессов обнаружена отчетливая отрицательная корреляция Так, для интенсивности транскрипции (ОУРРНК) эта зависимость имеет вид:
Связь СПЖ и МПЖ с интенсивностью трансляции (ОУРбе1ка) судя по парным коэффициентам корреляции была сильнее:
Наиболее слабая, но также достоверная корреляция была обнаружена между ПЖ и количеством выделяемого углекислого газа (CO2):
Как и в случае с температурой, расчет частных коэффициентов корреляции позволяет предположить, что причинная корреляция скорее всего может существовать между ПЖ и интенсивностью биосинтеза белка, тогда как корреляции с синтезом РНК и метаболизмом, по всей вероятности, формальные, обусловленные их тесной сцепленностью с биосинтезом белка.
Интересно сопоставление с температурой и ПЖ еще двух показателей. Первый - отношение интенсивности трансляции к транскрипции (ОУРбелка/ОУРРНК). Это отношение в условных величинах показывает число молекул белка, синтезируемых на 1 молекуле РНК, и является как бы коэффициентом полезного использования снятой с ДНК информации. Второй показатель аналогичен первому, но рассчитан для метаболизма и белка, как бы являясь коэффициентом метаболической эффективности белка (СО2/ОУРбелка). Легко заметить, что в оптимальном диапазоне температур величина ОУРбелка/ОУРРНК прогрессивно снижается, по существу повторяя ход кривых СПЖ или МПЖ (рис. 41). В этом диапазоне отношение СО2/ОУРбелка практически не изменяется. За пределами оптимальной температуры эти величины растут по мере увеличения температуры (рис. 42). Однако роль этих сдвигов в определении температурной зависимости ПЖ дрозофил остается нерешенной.
Ранее рядом авторов было показано, что метаболическая стоимость развития (метаболизм Xдлительность развития) дрозофил имеет форму вогнутой кривой с минимумом около 25 0C (Sacher, 1977), т. е. при этой температуре развитие идет по наиболее оптимальной «траектории» и на единицу синтезированной массы тела насекомых расходуется минимальное количество энергии.
Рис. 41. Отношение интенсивности транскрипции и трансляции (ОУР белок/РНК) (/) и метаболизма к трансляции (2) у дрозофил линии D-18, инкубированных при разных температурах.
Рис. 42. Количество синтезированного в течение всей имагональной жизни РНК (/), белка (2) и выделяемого углекислого газа (3) у дрозофил линии D-18, инкубированных при разных температурах.
Подобные идеи об оптимальных путях развития и жизнедеятельности не только на личиночной, но и на более поздних этапах онтогенеза плодотворно развиваются И. А. Зотиным (1982).
Проведенные нами исследования также свидетельствуют о существовании для имаго дрозофил оптимального диапазона температур, в котором количество израсходованной в течение всей жизни энергии достигает максимального уровня при 20- 25 0C. Более того, оказалось, что подобная зависимость верна и для количества синтезированного в течение всей жизни белка и РНК (рис. 42).
Таким образом, проведенный анализ позволяет заключить, что снижение температуры - самый простой и мощный фактор продления жизни. Механизм действия температурных факторов, очевидно, опосредован через базальные, общие для всех видов субклеточные структуры. В оптимальном диапазоне температур увеличение ПЖ сопровождается пропорциональным снижением интенсивности метаболических и биосинтетических процессов. Судя по расчетным величинам энергии активации в этом диапазоне лимитирующие ПЖ процессы имеют ферментативную или химическую природу, и скорее всего именно разной температурной зависимостью скоростей противоборствующих ферментативных и химических процессов старения и витаукта можно объяснить многократное увеличение ПЖ по мере снижения температуры инкубации холоднокровных. Вместе с тем совершенно очевидно, что практическая значимость этих работ в большей степени зависит от того, насколько реальны перспективы снижения температуры тела теплокровных организмов и, в частности, человека.
См. также: 
Теплокровные.
Обсудить на форуме
